高效液相色谱法同时测定肝达康颗粒中5种成分含量

毕秋左，钱 洲

（云南省曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000）

肝达康颗粒具有疏肝理脾、化瘀通络功效，用于治疗肝郁脾虚兼血瘀所致的肋痛腹胀、肋下痞块，疲乏纳差，大便溏薄，慢性乙型肝炎见上述证候者［1］。该制剂由柴胡（醋炙）、白芍（醋炙）、当归（酒炙）、枳实（麸炒）、青皮（麸炒）、茜草等组方。方中白芍养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳［2］，芍药苷为主要有效成分之一；枳实有行气宽中、消食、化痰功能［3］；青皮舒肝破气，消积化滞作用。枳实和青皮均属芸香科柑橘属，物质基础基本相同［4］，均含有橙皮苷、柚皮苷、芸香柚皮苷、新橙皮苷。该制剂收载于国家食品药品监督管理局国家药品标准，但该标准仅对芍药苷进行了含量测定［5］。为更全面地评价肝达康颗粒的质量，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法同时对其中芍药苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷5种主要成分的含量进行了测定。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1200型高效液相色谱仪，包括G1311A型四元泵、G1329A ALS型自动进样器、G1316A TCC型柱温箱和G1315D型可变波长紫外吸收检测器（美国Agilent公司）；MS205DU型电子天平（梅特勒-托利多贸易＜上海＞有限公司，精度为十万分之一）；WF-500EHT型超声波清洗机（宁波海曙五方超声波设备有限公司，功率为250 W，频率为45 kHz）。

图1 高效液相色谱图

1.2 试药

肝达康颗粒（国药集团德众＜佛山＞药业有限公司，国药准字 Z10980159，批号分别为 18010，18015，19001，规格为每袋4 g）；乙腈（色谱纯，德国默克股份有限公司，批号为75-05-8）；甲醇（分析纯，天津市风船化学试剂有限公司，批号为20181101）；水为娃哈哈纯净水；芍药苷对照品（批号为110736-201741，含量为95.7% ），橙皮苷对照品（批号为 110721-201818，含量为 96.2%），柚皮苷对照品（批号为 110722-201714，含量为 93.4%），新橙皮苷对照品（批号为 111857-20103，含量为99.2%），均购自中国食品药品检定研究院；芸香柚皮苷对照品（批号为101880，含量大于98%，江苏永建医药科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：依利特 Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（B）-水（A），梯度洗脱（0～30 min时 8%B，30～36 min时 8%B～13%B，36～60 min时 13%B～19%B，60～85 min时 19%B～33%B，85～90 min时 33%B～80%B，90～95 min时 80%B，95～100 min时 80%B～8%B，100～105 min时 8%B）；检测波长：237 nm；流速：1.0 mL ／min；柱温：30 ℃。

2.2 溶液制备

供试品溶液：取样品适量，研细，取2.0 g，精密称定，置150 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定，超声提取30 min，取出，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液，即得。

对照品溶液：取芍药苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品适量，精密称定，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解成每 1 mL 分别含 0.388 2，0.234 8，0.115 6，0.359 0，0.137 3 mg 的混合贮备溶液。再精密吸取上述贮备液2 mL，置10 mL容量瓶中，用70%甲醇稀释成每 1 mL 分别含 0.077 64，0.047 68，0.023 12，0.071 80，0.027 46 mg 的混合对照品溶液。

阴性对照品溶液：按肝达康颗粒处方工艺，制备不含白芍（醋炙）、枳实（麸炒）和青皮（麸炒）的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下3种溶液，按拟订色谱条件进样测定，色谱图见图1。可见，阴性对照无干扰，该方法专属性良好。

线性关系考察：精密吸取2.2项下对照品贮备溶液0.1，0.5，1.0，2.0，4.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，用 70%甲醇溶液定容，制成浓度梯度对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，以质量浓度（C）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 5种成分的线性关系考察结果

精密度试验：取2.2项下对照品溶液，按拟订色谱条件连续进样6次，测定。结果芍药苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.41%，0.59%，0.65%，0.38% ，0.62% （n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为18010）样品，约2.0g，精密称定，共6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果样品中芍药苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.20% ，0.33% ，0.48% ，0.31% ，0.56% （n＝6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为18010）样品，依法制备供试品溶液，于配制后 0，4，8，12，16，24 h 时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果芍药苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷峰面积的RSD分别为0.49% ，0.56% ，0.70% ，0.44% ，0.65% （n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取样品（批号为18010）适量，研细，取6份，每份约1 g，精密称定，置150 mL锥形瓶，精密加入2.2项下对照品贮备液4 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算含量。结果样品中芍药苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均含量分别为1.6935，0.8837，0.4297，1.8869，0.5083mg／g，详见表 3。

表3 样品含量测定结果（mg／g）

3 讨论

3.1 提取溶剂选择

曾比较了甲醇、70%甲醇、50%甲醇3种溶剂对样品提取效果的影响，结果显示，3种溶剂对各目标物的提取效率无明显差异。对比色谱图发现，以50%甲醇作为提取溶剂时目标峰附近杂质较多，参考文献［6］，故选择70%甲醇作为提取溶剂。

3.2 提取方法及时间选择

曾考察了超声提取和加热回流提取，加热回流提取所得样品溶液冷却后不易滤过，超声提取效果良好，且简便易行；再对提取时间 0.2，0.5，1.0 h 的提取效率进行考察，发现0.5 h和1.0 h提取效率无明显差异，参考文献［7］，故选择超声提取 0.5 h。

3.3 流动相选择

预试验中，比较了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.4%磷酸及乙腈-水，发现以乙腈-水系统作为流动相时，各成分峰型良好，基线平稳，分离效果符合要求，且配制简单方便，故流动相选择乙腈-水。

3.4 检测波长选择

采用二极管阵列检测器对样品进行全波长扫描，发现各待测组分于237 nm波长处响应均良好，故选择检测波长为237 nm。