甘蓼复合微生态制剂对凡纳滨对虾生长性能及其相关酶活性的影响

2020-10-16谢小东覃志彪于美玲胡庭俊韦英益

饲料工业 2020年18期

■匡娜朱瑜谢小东覃志彪施君于美玲胡庭俊韦英益

（广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei），属于节肢动物门（Arthropoda）甲壳动物亚门（Crustacea）软甲纲（Malacostraca）十足目（Decapoda）对虾科（Penaeidae）滨对虾属（Litopenaeus），原产地为中南美洲，因此又被称为“南美白对虾”[1]。凡纳滨对虾是世界第一养殖虾类，约占全球对虾养殖产量70%，占我国对虾养殖产量80%～90%，目前我国凡纳滨对虾种苗生产量已超过7 000亿尾[2]。由于养殖规模化的发展和集约化养殖模式的扩大，凡纳滨对虾病害流行日益加剧，给对虾养殖业带来了较大的经济损失。此外，市场上化学药物和抗生素的滥用，不仅导致病原菌耐药性，还会对养殖环境造成污染和破坏，给食品安全带来巨大的安全隐患。因此，寻求或开发高效、低毒、纯天然的复方微生态制剂，是目前水产养殖中亟待解决的问题。

我国中草药在水产养殖中的应用较为广泛，与其他药物相比，其具有利用率高、预防效果好、无毒、环境友好、成本低[3]等特点，因此研发有效的中草药来预防和治疗对虾疾病，促进对虾养殖业的可持续发展是近年来的研究热点。中草药复合微生态制剂作为一种促生长饲料添加剂或药物，不仅可以避免药物残留和耐药性等问题，还能调整水体生态环境的菌群，显著提升水产养殖产量。有研究报道，中草药和益生菌联合使用能促进养殖动物生长，增强机体免疫功能及抗病力等[4-6]。因此，复合微生态制剂的研究与开发在水产养殖应用中具有良好的前景[7-9]。本试验旨在以辣蓼、甘草、甘露寡糖（MOS）、地衣芽孢杆菌等为主要成分的复合微生态制剂对凡纳滨对虾的生长性能和相关酶活性的影响研究，探讨其作用与效果，以期为中草药复合微生态制剂在对虾养殖业中的推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物和试剂

甘草（饮片）和辣蓼（全草），购于广西玉林中药市场；甘露寡糖（含量99.2%），购于河南贵之恒食品添加剂有限公司；基础饲料为海大牌2 号料；恩诺沙星（浙江国邦药业有限公司）；益菌多（广西正格农牧科技有限公司）；地衣芽孢杆菌（活菌数1011个/g以上，购于山东中科嘉亿生物工程有限公司），地衣芽孢杆菌菌种由本实验室保存；酸性磷酸酶测试盒（ACP）、总抗氧化能力测试盒（T-AOC）、谷胱甘肽测试盒（GSH）、一氧化氮合酶测试盒（iNOS）、酚氧化酶测试盒（PO）均购自南京建成生物工程研究所；左旋多巴（L-DOPA）购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 试验动物

540尾凡纳滨对虾购于广西防城港市凡纳滨对虾种虾基地。

1.3 甘蓼复合制剂的制备

1 g/ml 甘草提取液：称取30 g 甘草，按照料液比1∶12 加入360 ml 双蒸水，浸泡半小时，武火煮沸后调至文火煎煮1 h。200目纱布过滤水煎液，滤渣再次加入360 ml双蒸水，重复前述煎煮步骤，水煎煮共3次。合并滤液，浓缩至30 ml，即得到生药含量为1 g/ml甘草提取液，放置4 ℃保存。

1 g/ml 辣蓼提取液：将晒干的辣蓼全草粉碎为粗粉备用。参照本实验室先前研究，称取30 g 辣蓼粗粉，按照料液比1∶30 加入900 ml 双蒸水，浸泡半小时，武火煮沸后调至文火煎煮1 h。200目纱布过滤水煎液，滤渣再次加入900 ml 双蒸水，重复前述煎煮步骤，水煎煮共3 次。合并滤液，浓缩至30 ml，即得到生药含量为1 g/ml辣蓼提取液，放置4 ℃保存。

甘蓼复合制剂的组成：2%甘露寡糖、1%辣蓼、0.1%甘草、地衣芽孢杆菌（106cfu/ml）按比例配比制备。

1.4 试验分组

试验设置6 个组即对照组和5 个试验组，每组3个重复。将凡纳滨对虾放置于200 L 塑料箱内，盛水1/2，每组90 尾，经暂养稳定后，分别投喂添加0.5%、1%、2%的甘蓼复合微生态制剂的基础饲料，空白对照组饲喂基础饲料，益生菌组饲喂添加市售产品益菌多的基础饲料，抗生素组饲喂添加恩诺沙星的基础饲料。

1.5 饲养管理

定时投喂（8：00、13：00、18：00），投喂量为虾体重的5%～8%，根据摄食情况具体调整。试验周期为3周，每天清污，两天换水1 次，换水30%左右，水温28 ℃，24 h充氧，养殖用水为卤水配置，盐度为25.0‰，自然光周期，对虾适应环境一周后，开始试验。

1.6 样品采集和检测指标

试验至第14 d 和21 d 对各组虾进行采样，测定凡纳滨对虾体重、血清酚氧化酶（PO）、肝胰脏相关酶活性等。

1.6.1 血液采集

抽血前用一次性无菌注射器预先抽取0.2 ml 预冷的抗凝剂（100 mmol/l 葡萄糖、30 mmol/l 柠檬酸三钠、26 mmol/l柠檬酸、510 mmol/l氯化钠、10 mmol/l乙二胺四乙酸二钠），酒精消毒后，从腹血窦抽血至1.5 ml 灭菌EP 管内，每组抽血完毕后，抗凝剂补足体积至与血液体积比为1∶1，然后1 500 r/min、4 ℃、离心10 min，取上清液低温（4 ℃）保存待测。

1.6.2 肝脏采集及处理

每尾虾在无菌环境下，剖取整个肝脏，置于无菌离心管（15 ml）加入9倍体积的预冷生理盐水，冰水浴中研磨，用冷冻离心机于4 ℃、1 500 r/min离心10 min，吸取上清进行分装，保存在-80 ℃，用于测定相关酶活性。

1.6.3 生长指标测定

养殖试验结束后，将试验虾饥饿24 h 后进行采样，测定每个养殖箱中试验虾总质量，记录虾尾数，测量所有试验虾个体体质量，用以计算增重率、特定生长率指标参数。

增重率(WGR，%)=(Wt-W0)/W0×100

特定生长率(SGR，%/d)=(LnWt-LnW0)/t×100

式中：Wt、W0——分别为终末均重和初始均重（g）；

t——试验天数（d）。

1.6.4 非特异性免疫指标测定

于养殖第14 d与21 d时分别采样测定。血清酚氧化酶（PO）测定以左旋多巴（L-dopa）为底物，参照Ashida[10]的方法做适当修改后进行。室温下，96 T 板内，依次加入100 μl 的磷酸钾盐缓冲液（0.1 mol/l，pH 值6）和100 μl 的L-DOPA（0.01 mol/l 水溶液），再加入100 μl血清。28 ℃，测OD490，每2 min测一次，测10次，每分钟变化0.001为一个酶活性单位。

总抗氧化能力（T-AOC）、酸性磷酸酶（ACP）活性、一氧化氮合酶（iNOS）活性、谷胱甘肽（GSH）含量均采用试剂盒并严格按照说明书方法测定，以考马斯亮蓝法蛋白定量。

1.7 数据统计与分析

试验所得数据采用SPSS 21.0 软件进行统计分析。试验数据以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示。

2 结果

2.1 甘蓼复合微生态制剂对凡纳滨对虾生长的影响(见表1)

表1 凡纳滨对虾生长性能

由表1 结果可知，各试验组凡纳滨对虾在21 d养殖试验结束时，平均体重均有所上升，其中低剂量组的增重率和特定生长率较高。表明，一定浓度的甘蓼复合微生态制剂具有促进对虾生长的作用。

2.2 甘蓼复合微生态制剂对凡纳滨对虾相关酶活性的影响

各试验组凡纳滨对虾在养殖14 d和21 d的免疫酶活性如表2、表3所示。在试验14 d时，高剂量组和益生菌组对虾iNOS活性均显著高于空白组（P＜0.05），试验21 d时，低剂量组对虾iNOS活性与空白对照组相比显著升高（P＜0.05），其余组与空白组相比差异不显著（P＞0.05），中剂量组、高剂量组、益生菌组和抗生素组对虾iNOS 活性无显著差异（P＞0.05），在养殖14 d、21 d时，中剂量组对虾T-AOC水平均显著高于空白对照组（P＜0.05），而益生菌组则显著低于空白对照组（P＜0.05）。其余各组对虾T-AOC水平在两个时期与空白组差异均不显著（P＞0.05）。在养殖14 d、21 d时，抗生素组对虾ACP活性显著低于空白组（P＜0.05），其余各试验组与空白对照组无显著差异（P＞0.05）。各试验组对虾GSH水平在养殖14 d与21 d时，与空白组相比均无显著差异（P＞0.05）。在养殖14 d时，各试验组PO活性与空白组相比无显著差异（P＞0.05），养殖21 d时，中剂量组对虾的PO活性显著高于空白对照组（P＜0.05），其余各组与空白组无显著差异（P＞0.05）。

表2 甘蓼复合微生态制剂对凡纳滨对虾相关酶活性的影响（试验14 d）

表3 甘蓼复合微生态制剂对凡纳滨对虾相关酶活性的影响（试验21 d）

3 讨论

3.1 甘蓼复合微生态制剂对凡纳滨对虾生长性能的影响

动物的生长受自身因素和外周因素影响，自身因素如种类、发育阶段和生理状态等，外在因素主要为环境因素，水生动物对环境因素变化更为敏感[11]。本研究在凡纳滨对虾的基础饲料中添加不同剂量的甘蓼复合微生态制剂，均能促进凡纳滨对虾的平均体重，其中添加0.5%甘蓼复合微生态制剂对凡纳滨对虾的生长最有利。结果与郭慧等[9]在饲料中添加浓度为0.2%的水解单宁对凡纳滨对虾的研究结果相似，其增重率、特定增长率和肥满度与0.1%添加组相比均有下降趋势。

3.2 甘蓼复合微生态制剂对凡纳滨对虾相关酶活性的影响

凡纳滨对虾为低等甲壳动物，其主要通过非特异性免疫系统起防御作用。对虾体液免疫系统包括酚氧化酶原激活系统、活性氧和活性氮生成系统等。PO是反映机体抗氧化、氧化机体有害物质能力的酶，在对虾免疫系统中具有重要作用[12]。本试验结果显示，连续饲喂21 d 添加1%甘蓼复合制剂能显著提高凡纳滨对虾血液中PO活性。李军涛等[13]研究发现随着杜仲叶提取物添加量的增加，对虾血清PO 活性呈先增加后降低的变化趋势，以0.3 g/kg组的PO活性最高，达3.77 U/mg。ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶，能够水解病原菌细胞表面的磷酸酯，从而发挥免疫功能[14]。本试验中，连续21 d在饲料中添加0.5%甘蓼复合制剂使对虾血液中ACP活性高于同期空白组，且各试验组ACP 活性在试验后期高于前期，这与王明华等[15]、郝凯[16]的研究趋势是一致的。

总抗氧化能力（T-AOC）常被用于综合评价机体总抗氧化系统功能状态。本试验中添加1%甘蓼复合制剂，连续饲喂21 d，对虾肝胰腺内T-AOC 水平显著高于同期空白对照组。胡俊茹等[17]研究发现黑水虻幼虫粉替代饲料中15%～20%的鱼粉可显著增强凡纳滨对虾幼虾血清中抗氧化酶的活性，进而提高机体的抗氧化能力。GSH 是水生无脊椎动物体内重要的非酶性抗氧化物，在机体清除氧自由基时发挥关键作用[18]。但本试验结果显示，在基础饲料中添加试验剂量范围内的甘蓼复合制剂，不会抑制对虾机体通过GSH 发挥抗氧化的作用。其原因可能与诸多因素有关，袁宏利等[19]发现氨氮胁迫会诱导黄河鲤幼鱼肝组织中还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量升高，影响水生动物体内的GSH含量变化。在养殖前期，基础饲料中添加2%甘蓼复合制剂显著提高对虾的iNOS活性，但在养殖后期，添加0.5%甘蓼复合制剂能显著提高对虾的iNOS活性。也许是因为在饲养早期阶段，甘蓼复合制剂的有效成分在对虾体内积累较少，故添加量较高的试验组表现出较明显的免疫效果。随着饲养时间的增长，添加量较少的试验组其有效成分在对虾体内积累到一定量时，发挥出明显促进效果，而添加量较高的试验组由于对虾体内过多的有效成分反而起抑制效果，其免疫性能相对于添加量少的组有所下降。

益生菌、益生元与中草药的复配应用因具有促进养殖动物生长、增强机体免疫功能及抗病力等功效，广泛应用于水产养殖业。汤菊芬等[20]将中草药与益生菌复配使用，有效提高了吉富罗非鱼的生长性能及抗病力。文国樑等[21]、于明超等[22]的研究显示，芽孢杆菌作为益生菌与中草药复配作为饲料添加剂，可有效提高南美白对虾的免疫相关酶活性，且效果优于单一使用组。本研究发现甘蓼复合制剂对南美白对虾各免疫指标具有不同程度的积极作用且效果在部分免疫指标方面优于同期使用抗生素、市售益生菌组。甘蓼复合制剂在养殖的不同时间阶段作用也有所不同，这可能是由于其成分种类多，包括寡糖、两味中草药以及地衣芽孢杆菌。