响应面法优化籽瓜皮瓤饲料发酵工艺的研究

■买尔哈巴·艾合买提 杨新平 龙宣杞 杨 蓉 张日俊

（1.新疆农业科学院微生物应用研究所新疆特殊环境微生物重点实验室，新疆乌鲁木齐830091；2.中国农业大学饲料生物技术实验室 动物营养学国家重点实验室，北京100193）

籽瓜属葫芦科(Cucurbitaceae)西瓜属(Citrullus)西 瓜种(Lanatas)栽培西瓜亚种(ssp.vulgaris)的一个变种(var.megalasperms Linet Chao)，是“籽用西瓜”的简称[1]，又名打瓜，一年生草本植物，喜生长在沙壤土中，耐瘠薄，耐旱怕涝，喜温耐热，具有很高的食用价值和经济价值[2]。籽瓜分黑籽瓜和红籽瓜2 种，黑籽瓜盛产于新疆、甘肃、内蒙古、宁夏、青海五省区，红籽瓜主要分布在广西、安徽、江西、湖南、黑龙江及广东等省区，呈现出南“红”北“黑”的生产格局[3]。

目前籽瓜已成为新疆的特色产业，尤其是北疆的塔城和阿勒泰两地区，2018 年籽瓜生产面积就达21 万公顷以上，产量达30万吨[4]。随着种植范围的扩大，随之而来的是农副产物的后处理问题。籽瓜主要是以取籽加工为主，瓜皮瓜瓤丢弃在田间，造成巨大的资源浪费和环境污染。籽瓜取籽加工后的副产物籽瓜汁、籽瓜瓤和籽瓜皮的再利用，不仅能提高籽瓜的经济价值，还能减少环境污染。因此，亟需对此进行资源的开发与应用。

目前国内对于籽瓜的研究多为籽瓜皮和瓤中有效活性成分的提取和利用等[5-9]，还未有研究作为饲料使用。针对目前籽瓜瓜瓤、瓜皮部分因无法得到及时有效地加工利用造成的资源浪费现状，可利用微生物发酵技术对籽瓜皮瓤进行发酵制作饲料，不仅提高营养价值，还可以缓解发展现代畜牧业与饲料来源不足的矛盾，且技术简单易行、便于推广，发展前景十分广阔，也是畜禽饲料资源开发的安全高效方法。

1 材料与方法

1.1 发酵原料

籽瓜、干麦草和豆粕粉，均由新疆乌鲁木齐五家渠103团团场提供。

菌种：嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，由新疆农业科学院微生物应用研究所菌种保藏中心保藏。

发酵袋：具有单向排气阀装置，规格50 cm×80 cm，袋装容量30 kg。

培养基：浓度为5 g/l 的葡萄糖活化溶液，用于活化冻干菌粉。

1.2 籽瓜发酵饲料制备

1.2.1 原料预处理

选取新鲜无腐烂籽瓜皮瓤，将籽瓜皮粉碎为颗粒，籽瓜瓤匀浆，混合后沥干水分6～8 h，备用；干麦草和豆粕粉碎备用。

1.2.2 菌剂制备

将嗜酸乳杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌经培养基活化并配置成活菌数分别为105、106、107cfu/g 的冻干菌粉，以1∶1∶1混合制备复合菌发酵菌剂。

1.2.3 试验设计及发酵

试验将复合菌发酵籽瓜皮瓤饲料设计4个处理，CK处理(不添加任何菌)；处理1(添加105cfu/g的复合菌)；处理2(添加106cfu/g的复合菌)；处理3(添加107cfu/g的复合菌)。将准备好的籽瓜皮瓤、干麦草和豆粕按7∶2∶1比例混合，按照3%重量比分别添加复合菌发酵菌剂，充分搅拌混合均匀发酵原料后以30 kg/袋的量装入发酵袋中，每装20 cm高度做一次踩实压紧，密封；发酵初始温度为37 ℃，发酵时温度不高于42 ℃，发酵30 d后取样进行感官评价(见表1)、发酵品质和营养成分测定。

表1 感官评分标准(满分30分)

1.2.4 发酵工艺参数的优化

①单因素试验。在复合菌发酵籽瓜皮瓤饲料中，很多因素影响发酵效果，选定复合菌接种量、发酵温度和发酵时间为因素进行单因素试验，以确定主要影响因素。②响应面法分析。根据单因素试验结果，确定影响发酵的主要因素，根据Box-Benhnken 中心组合设计原理进行试验设计[10-12]，然后通过采用Design Expert 8.0.6软件分析，确定响应面分析的因素水平，获得优化分析表，通过试验结果得出理论最佳条件，并进一步进行验证试验以检验模型的有效性。

2 结果与分析

2.1 不同处理发酵后各项指标检测结果

2.1.1 感官评价(见表2)

根据感官评定结果所示，相对于CK组，其他处理组的色泽都是黄绿色，呈酸香味，发酵原料质地结构良好、分布均匀，未出现霉菌污染或腐败的现象；三个处理组的评分在26～28分之间，均高于25分，属于1级优良；CK组呈现出棕黄色、酸味，质地结构较差，并有轻度霉菌污染的情况，总评分为10分，属于3级腐败。

表2 籽瓜皮瓤发酵型复合饲料感官评价

2.1.2 不同处理对发酵品质及营养成分的影响(见表3)

从表3中可以看出，与CK组相比，不同处理组对籽瓜皮瓤发酵型复合饲料的总能、粗蛋白和粗脂肪均存在显著影响(P＜0.05)；三个处理组粗灰分含量均显著低于对照组(P＜0.05)；pH 值、半纤维素和纤维素含量在各组之间差异未达到显著水平(P＞0.05)；不同复合菌处理组对有机酸含量存在显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)的影响，各处理组中乳酸和乙酸含量表现为处理3＞处理2＞CK＞处理1，其中处理3 组的乳酸含量较CK 组提高了63.95%，较处理2 组提高了30.76%；其乙酸含量分别是CK、处理1和处理2组的3.04、3.07和1.51倍，差异均表现出极显著水平(P＜0.01)；各处理组中丙酸含量表现为处理2＞处理3＞处理1＞CK，其中处理2和处理3显著高于处理1和CK组；各组丁酸含量呈现出CK＞处理1＞处理2＞处理3，其中三个处理的丁酸含量极显著低于CK组(P＜0.01)；这说明发酵饲料中有机酸的含量和种类与添加的复合菌活菌数呈现一定的剂量依赖性。

2.1.3 不同处理对氨基酸含量的影响(见表4)

表4中列出了饲料发酵前后的氨基酸含量变化，可以看出，经发酵后原料中Asp、Thr、Gly、Ala、Met、Tyr、His、Trp 的含量增加了10.21%～12.31%，Ser、Glu、Val、Leu、Phe、Lys、Pro、Arg、Cys 的含量增加了5.12%～9.26%；这说明复合菌混合发酵增加了饲料中的氨基酸含量，提高了籽瓜皮瓤型复合饲料的营养价值。

表3 不同处理组籽瓜皮瓤发酵型复合饲料发酵品质及营养成分(鲜样基础，%)

表4 不同处理组氨基酸含量

2.2 单因素试验

2.2.1 接种量对籽瓜皮瓤发酵型复合饲料乳酸含量的影响

以30 kg/袋的量准备发酵原料，分别以接种量为1%、2%、3%、4%、5%的比例添加复合菌剂充分混匀，每个处理3个重复，发酵温度为37 ℃，发酵30 d后取适量样品测定乳酸含量，结果如图1。

由图1可知，籽瓜皮瓤复合型发酵饲料中的乳酸含量随着接种量的增加出现了先升高后降低的趋势，且30 kg 发酵底物接种量为3%时的乳酸含量达到最高，为20.11%，之后又有所降低。接种量是影响发酵效果的重要因素之一，接种量低，微生物生长量不足，发酵周期延长，发酵不彻底，影响产物合成；接种量过高则微生物生长过度，容易造成底物缺氧，导致微生物活性产物的分泌受到抑制，发酵效果较差。另外，随着乳酸含量的增加，pH逐渐降低，过酸的环境抑制菌体的生长，因而发酵底物中乳酸含量会出现先升高后降低的现象。由单因素方差分析的结果可知，接种量对复合发酵饲料的乳酸含量有显著的影响。

图1 接种量对籽瓜皮瓤发酵饲料乳酸含量的影响

2.2.2 发酵初始温度对籽瓜皮瓤发酵型复合饲料乳酸含量的影响

以30 kg/袋的量准备发酵原料，以3%的接种量添加复合菌剂搅拌混匀，分别置于22、27、32、37、42 ℃发酵，每个处理3 个重复，发酵30 d 后取适量样品测定乳酸含量，结果如图2。

图2 发酵初始温度对籽瓜皮瓤发酵饲料乳酸含量的影响

图2中的结果表明，复合发酵饲料中的乳酸含量随着初始温度的升高出现先升高后降低的趋势，温度为37 ℃时乳酸含量达到最高，为19.79%，之后逐渐降低。微生物生长都有各自的最适生长温度，温度变化对每种类型微生物的代谢生长过程都会产生影响，从而改变它们的生长速率，以适应温度的变化而生存，温度过高或过低均不利于微生物的代谢活动，从而影响发酵效果。试验中控制适当的发酵温度显得尤为重要。由单因素方差分析可知，温度对发酵籽瓜复合型饲料中的乳酸含量有显著影响。

2.2.3 发酵时间对籽瓜皮瓤发酵型复合饲料乳酸含量的影响

以30 kg/袋的量准备发酵原料，以3%的接种量添加复合菌剂搅拌混匀，置于37 ℃分别发酵10、20、30、40、50 d，每个处理3个重复，发酵结束后取适量样品测定乳酸含量，结果如图3。

图3 发酵时间对籽瓜皮瓤发酵饲料乳酸含量的影响

由图3可知，籽瓜皮瓤发酵复合型饲料中的乳酸含量在10～30 d内呈现增加的趋势，发酵30 d时乳酸含量达到最高，为20.03%，之后逐渐降低。由单因素方差分析可知，发酵时间对籽瓜皮瓤发酵饲料中乳酸含量有显著影响。

2.3 响应面法分析

通过单因素试验可知接种量、发酵温度和发酵时间对籽瓜皮瓤发酵饲料中的乳酸含量具有显著的影响，针对响应面分析的试验设计因素及水平见表5。采用Design Expert 8.0.6 软件进行分析，响应面试验设计及试验结果见表6。

采用Design Expert 8.0.6 软件分析后得出优化的响应值的动态参数方程。

表5 响应面试验设计因素水平及编码

以籽瓜皮瓤发酵型复合饲料中乳酸含量为优化指标，三因素两两组合的响应面立体图见图4。

通过软件分析可知，决定系数R2=0.974 6,说明三个因素及二次项能很好地解析Y的变化，Y的变异系数为0.34%，说明模型拟合程度很好。回归模型存在稳定点，稳定点是极大值点，得到极大值时所对应的各主要因素的编码(A，B，C)分别为(0.074，-0.026，-0.146)。其对应的实际值(3.15，36.87，28.53)最佳发酵条件：接种量为3.15%，发酵温度为36.87 ℃，发酵时间为28.53 d。

图4 接种量、发酵温度与发酵时间的响应面图和等高线图

2.4 验证试验

以最佳发酵条件参数进行验证试验，测得籽瓜皮瓤发酵饲料中乳酸含量19.71%，模型预测的乳酸含量理论结果为19.69%，理论值与试验值之间良好的拟合性证实了模型的有效性，说明该模型能很好地反映实际的发酵情况。

3 讨论

籽瓜是一种营养含量丰富的食品,其富含钾、钙、镁、铁、锌、硒等微量元素，瓜籽中的维生素D、B6、E、B2含量相对较高，瓜皮和瓜瓤中的维生素C含量相对较高[13-14]。此外，籽瓜籽是一种优质的蛋白质来源，蛋白质含量为35%左右[15]。本研究中籽瓜与干麦草和豆粕粉混合复合菌发酵处理后，显著提高了饲料的总蛋白和氨基酸含量。发酵产物与对照组相比，在感官评价上具有较强的芳香味或酸香味，可使皮瓤结构保持良好，提高了发酵饲料的适口性，同时具有较高的干物质和多糖含量，较低的灰分，在一定程度上减少了籽瓜皮瓤饲料的营养损失，提高其可消化性。

籽瓜皮瓤原料中的水分含量较高，处理前的晾晒和水分的控制是比较关键的一步，因此本研究中原料的水分控制在70%，以避免水分太高而导致霉变。选择合适的发酵菌剂是提高发酵品质的质量保障，我们选择了发酵饲料常用的三种微生物菌种。乳酸菌被认为是发酵饲料中最重要的因素之一，它能够迅速产生乳酸降低饲料pH值，抑制霉菌和梭状芽孢杆菌等有害菌的生长从而使发酵饲料得以保存[16-18]。酿酒酵母是最为常见的发酵菌株，其不但富含齐全的营养物质，且经酵母菌发酵过的饲料也具有独特的色、香、味，饲料适口性得到显著改善[19]。枯草芽孢杆菌作为一种常用于固态发酵饲料的菌种，自身蛋白含量较高，可以分泌蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶类，提高发酵饲料中粗蛋白、小肽、维生素和异黄酮苷的含量，从而增强抗氧化能力[20]。因此，对于从未研究过制作发酵饲料的籽瓜原料来说，选择适当的微生物添加剂以及接种量是具有挑战性的尝试。

发酵饲料中有机酸的含量也是评价其品质优劣的标准之一。本研究结果显示，复合微生物处理组有效增加了乳酸、乙酸和丙酸在总有机酸中所占比例，而减少了丁酸所占比例，达到了差异显著水平。除了复合菌活菌数不同的影响以外，其他发酵工艺条件也会影响发酵产物的品质，尤其影响乳酸含量。考虑到众多因素中影响发酵品质的最关键的几个因素，我们利用单因素试验考察了接种量、发酵温度和发酵时间对乳酸含量的影响，再通过响应面法优化了籽瓜发酵饲料的发酵工艺，以此进一步提高发酵品质。

利用现代饲料生物技术手段能及时有效地对籽瓜瓜瓤、瓜皮加工利用，节约资源，保护农田的生态平衡，有利于提高籽瓜生产基地的竞争力，同时利用微生物发酵技术获得的安全高效的籽瓜皮瓤发酵型复合饲料，是缓解当前人畜争粮矛盾的重要途径。

4 结论

表6 响应面试验设计与结果

利用响应面分析法中的Box-Behnken design中心复合试验，以接种量3%、发酵温度37 ℃、发酵时间30 d为水平中心点进行响应面设计，优化了籽瓜皮瓤发酵型复合饲料的最佳发酵工艺。单因素试验结果表明，接种量、发酵温度和发酵时间对试验结果具有显著性影响。通过响应面优化籽瓜皮瓤复合饲料发酵工艺，最佳发酵条件：接种量为3.15%，发酵温度为36.87 ℃，发酵时间为28.53 d。在此条件下测得发酵产物中的乳酸含量为19.71%。验证试验证明该参数可行。

因此，本研究结果为实际生产籽瓜复合发酵饲料的工艺提供试验与理论支撑，但是仍需要进行放大试验、中试等进一步研究，以更好地应用实际生产。