狂犬病病毒抗原的浓缩及纯化工艺的研究

2020-10-16龚本义刘冬禹杨丹丹殷玉和吴丛梅

兽医导刊 2020年14期

张宁龚本义刘冬禹杨丹丹殷玉和吴丛梅

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012）

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种传染病，一旦发病100%死亡[1]。狂犬病病毒属于弹状病毒科，是一种广泛传播的人畜共患疾病[2]。目前，狂犬病除了临床和实验室评估外，狂犬病的预防和控制还取决于快速、具体的诊断技术[3]。本试验根据需要设计了3种不同浓缩纯化方法，建立了PEG沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化、Zn（AC）2沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化、Zn（AC）2沉淀浓缩及Sepharose 4 Fast Flow分离纯化制备狂犬病病毒抗原，为狂犬病抗体荧光微球检测试纸奠定了基础。

1 材料

1.1 抗原、血清及细胞

狂犬病病毒CVS-11株病毒液由北京大北农科技集团股份有限公司提供；

狂犬病阳性血清由军事医学科学院军事兽医研究所惠赠；

阴性血清由长春西诺生物科技有限公司提供；

BHK-21细胞引自中国兽医药品监察所。

1.2 试剂

PEG 6000、Zn（AC）2、蔗糖等购自北京化工厂以及Ameresco公司；Sepharose 4 Fast Flow 凝胶购自GE Healthcare公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG 购自上海远慕生物科技有限公司。

2 方法

2.1 狂犬病灭活病毒液制备

狂犬病病毒CVS-11株病毒液，灭活后制成病毒液[4]，检验合格后，-20℃以下保存备用。

2.2 抗原浓缩纯化工艺的研究

将病毒液，4℃、3000r/min离心30min，取上清备用。

2.2.1 PEG沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化上清液加入NaCl使终浓度为0.5mol/L，加等量10% PEG 6000，4℃过夜，8000r/min离心30min，沉淀加入PBS后为浓缩病毒。取浓缩液以蔗糖密度梯度离心进行纯化（梯度依次为20%、30%、40%、55%），可见40～55%间有白色条带，用试剂盒进行检测确定此条带为纯化狂犬病病毒。

2.2.2 Zn（AC）2沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化上清液加入Zn（AC）2，静置30min，10000r/min 4℃离心30min，沉淀以饱和EDTA 悬浮，4℃溶解至溶液透明，3000r/min 4℃离心30min，上清即为病毒浓缩液。取其以蔗糖密度梯度离心进行纯化，可见40～55%间有白色条带，用试剂盒进行检测确定此条带为纯化狂犬病病毒。

2.2.3 Zn（AC）2沉淀浓缩及Sepharose 4 Fast Flow纯化上清液加入Zn（AC）2，静置30min，10000r/min 4℃离心30min，沉淀以饱和EDTA悬浮，4℃溶解至溶液透明，3000r/min 4℃离心30min，上清即为病毒浓缩液。用 Sepharose 4 Fast Flow对浓缩病毒液进行纯化[4]。