混合型饲料添加剂液态亚洲薄荷素油·桉叶油含量检测方法研究

林章秀 厦门惠盈动物科技有限公司 福建厦门 361023

随着社会经济的发展和人民生活水平的不断提高， 人们对安全优质的动物性食品的需求量也日益增加。 然而，目前食品安全事件不断曝光，食品安全问题日益突出，人们对食品安全的呼声越来越高，安全、 高效和环境友好型的饲料添加剂已成为饲料行业的大势所趋。我国具有丰富的中草药资源，民间应用中草药来防治动物疾病有着悠久的历史。 中草药取自天然动植物产品，保持了其成分、结构的自然状态和生物活性，其有效成分与药理作用密切相关。有效成分及其药理功能，是防治动物疾病的物质基础。薄荷脑是亚洲薄荷素油的主要成分， 具有特殊的芳香、辛辣感和凉感，归肺、肝经，有发散风热，清利咽喉，透疹解毒，疏肝解郁和止痒等功效；在鸡养殖上应用，具有缓解呼吸道黏膜肿胀的问题，对鸡只因饮水不足、饲料积存嗉囊、接种疫苗后出现呼吸问题等诱发的呼吸道积痰症状有特效， 通过刺激呼吸道绒毛活动来化痰。是农业部批准使用的食品香料，可作为饲料添加剂使用。 薄荷素的测定方法主要有GB/T 12652 亚洲薄荷素油[1]、GB 8319 食品添加剂 亚洲薄荷素油[2]、《中华人民共和国药典》[3]。

桉叶油，主要成分为1，8-桉叶素，具有1，8-桉叶素的特征香气，稍带有樟脑样气息和辛辣凉味，具有杀菌作用及有一定防霉及杀菌防腐作用。 已证明1，8-桉叶素有很强的抗菌活性， 能增强动物体对营养物质的消化吸收能力， 提高生长性能和饲料利用率。桉叶油是农业部批准使用的食品香料，可作为饲料添加剂使用。 目前1，8-桉叶素的检测方法主要有GB 1886.33 食品安全国家标准 食品添加剂 桉叶油（蓝桉油）[4]。

对于同时检测薄荷脑和1，8-桉叶素的方法尚未见报道，本研究开发出采用气相色谱法（GC-FID）同时检测液态亚洲薄荷素油·桉叶油样品中的特征组分薄荷脑 （CAS：89-78-1） 和1，8-桉叶素（CAS：470-82-6）的方法，试验证明，该方法准确快捷、操作简单，可以用于液态亚洲薄荷素油·桉叶油样品的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 气相色谱仪，配氢火焰离子化检测器-FID 及配套工作站 （北京普析通用仪器）；MS105DU 分析天平（梅特勒-托利多）；XH-CA 旋涡混均器（无锡沃信仪器制造有限公司）；超声波处理器（广东固特超声股份有限公司，功率：240 W）。

1.2 材料与试剂 无水乙醇（分析纯）、甲醇（分析纯）、三氯甲烷（分析纯）、 薄荷脑对照品（CAS:89-78-1）、 1，8-桉叶素对照品 (桉油精对照品，CAS：470-82-6)。称取一定量的对照品，用无水乙醇溶解、定容，并逐级稀释成试验所需的浓度，再配制成相应浓度的薄荷脑、1，8-桉叶素混合标样。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 检测器：FID 检测器；毛细管色谱柱：ZB-WAX 柱，0.25 μm× 0.32 mm× 30 m； 气体总类包括，载气：氮气（纯度不小于99.999%），焰气：氢气（纯度不小于99.99%），助焰气：空气（压缩空气）；进样口：230 ℃；检测器：300 ℃；程序升温：柱箱，初温100 ℃，升温速度为10 ℃/min，终温300 ℃，保留时间3 min；气体流量：柱流量1.85 mL/min，氢气40 mL/min，空气400 mL/min，尾吹气30 mL/min；进样量：1 μL；分流比：20:1。

1.3.2 样品前处理 称取样品0.4～0.5 g （精确至0.0001 g），置于50 mL 容量瓶中，用无水乙醇溶解，超声10 min，冷却，用无水乙醇定容，摇匀。 经0.45 μm 微孔滤膜过滤，吸取1 μL 标准储备液和样品稀释液分别注入气相色谱仪，根据保留时间定性，外标法定量。

1.3.3 测定 按1.3.1 色谱条件， 待仪器稳定后，对标准溶液和试样溶液进行气相色谱分析。

1.3.4 系统适应性试验 按1.3.1 色谱条件，分别吸取空白基质溶液、对照品溶液、样品溶液各1 μL，分别注入气相色谱仪中测定。

2 结果与分析

2.1 色谱方法条件的选择 分别吸取空白基质样品溶液、混合对照品溶液、样品溶液、空白基质加标样溶液，按所述色谱条件测定。 结果表明，空白基质样品在目标化合物保留时间处无杂质峰干扰， 样品其质中其它成分不干扰目标化合物测定， 并且能够在最短时间内实现目标化合物完全分离， 方法特异性强，适用于混合型饲料添加剂中薄荷脑和1，8-桉叶素含量测定，见图1-图4。

图1 空白基质样品气相色谱图

图2 对照品薄荷脑和1,8-桉叶素气相色谱图

2.2 方法的线性范围及相关系数 将薄荷脑、1，8-桉叶素的标准系列溶液在上述气相色谱条件下进样分析，以标准溶液浓度为横坐标、对应的峰面积为纵坐标，拟合标准曲线，得到相应的线性回归方程及相关系数，根据3 倍噪比计算方法的检测限，以10 倍信噪比计算方法的定量限。 结果见表1、图5-图6。

测定薄荷脑的线性范围及相关系数：y=ax+b，其中 a =1734190，b =-16976.04，R2=0.9999360，R =0.999968。

测定1，8-桉叶素的线性范围及相关系数：y=ax+b， 其中a=2453878，b=-20477.88，R2=0.9999549，R=0.9999775。

图3 样品中薄荷脑和1,8-桉叶素气相色谱图

图4 空白基质加标样气相色谱图

表1 2 种目标化合物线性方程及相关系数

图5 测定薄荷脑的线性作图

图6 测定1,8-桉叶素的线性作图

进行外标法定量测定。校准曲线：线性，零点：不强制，见表2。

表2 外标法定量测定设计

2.3 方法的回收率和精密度 向空白基质样品中分别添加Ⅰ(10 mg/g)、Ⅱ(20 mg/g)、Ⅲ(50 mg/g)三个浓度水平的混合标样，每个水平进行6 次平行测定，回收率和精密度结果见表3，色谱图见图4。

表3 加标回收试验结果（n=6）

2.4 溶液稳定性试验 按上述前处理方法制备样品溶液 （薄荷脑50 mg/g、1，8-桉叶素40 mg/g），密封， 保存在室温环境中， 隔2 h、4 h、8 h、24 h、48 h按前述方法测定2 种目标化合物含量，结果见表4，表明样品溶液在48 h 内稳定。

2.5 不同色谱柱的选择 色谱柱的选择[5]对分析方法是否成功是一个很重要的问题，固定相类型、目标化合物的化学结构和组分极性， 是色谱柱选择主要考虑的因素。混合型饲料添加剂液态亚洲薄荷素油·桉叶油是以亚洲薄荷素油（薄荷脑）、桉叶油（1，8-桉叶素）、吐温80、聚二醇400 等乳化制成的。 因此，色谱柱选择要考虑薄荷脑、1，8-桉叶素的分子结构，还要考虑基质干扰等因素。 本试验采用了3 种不同极性的色谱柱：ZB-35 毛细管色谱柱、ZB-WAX 毛细管色谱柱、ZB-624 毛细管色谱柱，综合考虑了峰形、灵敏度、检测时间、基线漂移等色谱分析因素，ZBWAX 毛细管色谱柱效果最好并选为本试验用色谱柱。

2.6 柱温和柱流量的优化选择 为了提高分离效果， 应对升温程序和色谱柱的气体流量进行优化选择。本研究反复试验比较了不同的初始温度、升温速率、 柱流量后， 确定仪器参数为： 进样口温度：230 ℃；色谱柱升温程序：100 ℃保持10 min，每分钟升10 ℃，至150 ℃保持3 min；检测器温度：300 ℃。气体流量：柱流量1.85 mL/min，氢气40 mL/min，空气400 mL/min，尾吹气30 mL/min。

2.7 提取溶剂的选择[6]选择3 种试剂作为样品的提取溶剂：甲醇、无水乙醇、三氯甲烷。 试验表明，甲醇、 无水乙醇、 三氯甲烷均能很好地提取目标化合物。 但由于三氯甲烷、甲醇毒性大；三氯甲烷为易制毒试剂，不易购买；乙醇毒性小，价格便宜，易于购买。 所以，本试验选择无水乙醇作为提取溶剂。

2.8 实际样品测定 用公司生产的混合型饲料添加剂液态亚洲薄荷素油·桉叶油混合剂进行测定。准确称取样品0.4～0.5 g （精确至0.0001 g）， 置于50 mL 容量瓶中，用无水乙醇溶解，超声10 min，冷却，用无水乙醇定容，摇匀。采用GC-FID 测定，色谱图见图3，测定结果与产品成分分析保证值相符。

表4 样品溶液稳定性

3 结 论

本研究建立的可同时测定薄荷脑、1，8-桉叶素的气相色谱法， 具有样品前处理简单及强特异性的优点，具有较宽的线性范围及显著的线性关系，加标回收率高，重现性好；使用仪器设备普及率高，可在混合型饲料添加剂液态亚洲薄荷素油·桉叶油混合剂的质量检测及企业标准制定中加以推广应用。