乳鸽源绿脓杆菌的分离与鉴定

李冰心 程柏丛 王 俊 杨秀环 孙梦许

（1.北京市大兴区动物疾病控制中心 北京 102600；2.北京市畜牧兽医总站 北京 100107；3.中国农业大学动物医学院 北京 100193）

绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又称为铜绿假单胞菌，Gersard 于1882 年首次从伤口脓液中分离得到， 该菌广泛存在于自然界的水和土壤中以及动物肠道和皮肤表面， 是典型的人兽共患条件致病菌，通常引起人皮肤化脓性感染，常见于烧烫伤患者。随着集约化养殖的快速发展，绿脓杆菌感染畜禽的报道日渐增多， 已有报道绿脓杆菌感染引起水貂出血性肠炎、 母狐流产和羊化脓性肺炎等严重疾病，若治疗不当病死率较高，造成严重损失[1-3]。 此外，近年来在我国养禽业中，雏鸡、雏鸭因早期疫苗接种而感染绿脓杆菌屡有发生[4-5]，但出生2～3 d 的乳鸽暴发绿脓杆菌感染， 造成大量乳鸽死亡的病例较少见。

2019 年6 月， 石家庄市某肉鸽养殖场出壳的2 450 羽乳鸽出现发病，发病乳鸽生长缓慢、精神不振，眼睑肿胀，胸部、腹部皮肤可见肿块，每天死亡最多时可达200 羽， 在出壳10 d 内累计死亡超过30%。经实验室病理剖检和病原分离鉴定，确诊为绿脓杆菌感染， 并对分离菌株进行了药敏试验和毒力基因检测等研究， 为预防和控制该病的流行提供参考依据。 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源 河北省石家庄市某肉鸽养殖场送检的死亡乳鸽。

1.2 主要试剂 Tryptic Soy Agar 培养基、麦康凯琼脂培养基和Tryptic Soy Broth 培养基购自美国BD公司； 犊牛血清购自北京政博伟业生物科技公司；2×Taq PCR-Mix（含染料）购自北京康润生物科技公司；药敏纸片购自北京天坛生物制品股份有限公司。

1.3 细菌分离培养与纯化 死亡乳鸽眼眶边缘、胸部和腹部有乳白色肿块， 切开可见干酪样物和血性渗出液，剖检乳鸽发现肝脏肿大。无菌采集乳鸽体表局部病灶渗出液和肝脏组织， 分别划线接种于含2%血清的TSA 平板和麦康凯平板， 置37 ℃温箱培养16～24 h，观察菌落形态特征。 挑取典型单一优势菌株的单菌落， 再次划线接种于含2%血清的TSA平板进一步纯化培养，纯化的细菌经革兰氏染色，镜下观察菌体形态特征。

1.4 病毒分离 无菌采集死亡乳鸽的肝脏和脾脏，用玻璃研磨器充分研磨成组织悬液，反复冻融3 次。8 000 r/min 离心5 min， 取上清液用0.22 μm 滤膜除菌。 过滤液经尿囊腔接种3 枚9 日龄SPF 鸡胚（0.2 mL/枚），每隔12 h 照胚一次，连续观察5 d。 收取尿囊液继续盲传3 代。

1.5 分离菌株的分子生物学鉴定 利用煮沸裂解法提取分离菌株的基因组DNA，作为PCR 的模板，以细菌16S rRNA 基因通用引物对细菌的16S rRNA 基因片段进行PCR 扩增。引物序列：上游引物5'-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3'，下游引物5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'， 目的条带759 bp。PCR 反应体系50 μL：2× Taq PCR-Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 21 μL。 PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 个循环；72 ℃延伸10 min。 PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，符合目的大小的阳性PCR 产物送到北京擎科生物有限公司进行测序。 将分离菌株的16S rRNA 基因序列测序结果在NCBI 网站在线BLAST 比对

1.6 药敏试验 采用K-B 纸片扩散法进行药敏试验。 将纯培养物接种于营养肉汤培养基，37 ℃振荡培养16~18 h 后将培养物稀释成0.5 麦氏单位的菌液。 无菌条件下将菌液均匀涂布在TSA 培养基上，选取12 种抗生素，用无菌镊子夹取药敏纸片贴于培养基表面，37 ℃培养16~24 h 后， 测量抑菌圈直径并根据CLSI 标准判断敏感性。

2 结 果

2.1 临床发病和死亡统计 2019 年6 月下旬，河北石家庄市某肉鸽养殖场出雏2 450 羽， 乳鸽从出壳第3 d 开始出现死亡（60 羽）；随后每天死亡数逐渐升高，在5 日龄时死亡乳鸽高达200 羽，后续每天死亡数量逐渐下降；到10 日龄时，该批乳鸽累计死亡率超过30%（750/2 450）。 发病乳鸽体温升高，精神沉郁，死亡乳鸽外观消瘦、脱水，眼眶边缘、胸部和腹部有乳白色肿块，切开可见干酪样物和血性渗出液，剖检乳鸽发现肝脏出血肿大（见图1）。

2.2 病原分离培养特征和形态观察 从送检的死亡乳鸽体表病灶和肝脏中分离到一株优势菌。 分离菌株在含血清的TSA 平板上生长迅速， 形成光滑、湿润、中央隆起、边缘不整齐的中等大小菌落。 菌落产生蓝绿色色素，周围培养基呈淡绿色，有特殊芳香气味。 该菌在麦康凯培养基生长良好，呈无色、半透明的圆形菌落。 经革兰氏染色，镜下可见两端钝圆、单个或成对的革兰氏阴性短小杆菌。 将乳鸽肝脏和脾脏组织过滤液接种SPF 鸡胚5 d 后，无鸡胚死亡，盲传三代后未见鸡胚死亡。 无菌收集尿囊液检测无血凝活性，表明未分离到病毒。

2.3 细菌16S rRNA 基因片段序列分析 通过PCR 扩增细菌16S rRNA 基因的保守序列， 扩增产物与预期大小基本相符（见图2）。 对PCR 产物进行测序，BLAST 比对结果显示分离菌株与GenBank 中登录的绿脓杆菌参考序列的同源性高达99.33%，表明分离菌株为绿脓杆菌。

图1 死亡乳鸽病变图

图2 分离菌株16 S rRNA PCR 产物电泳图

2.4 药物敏感试验结果 选择12 种抗生素进行药敏试验，结果显示分离菌株对环丙沙星、头孢吡肟、阿米卡星、诺氟沙星、氧氟沙星和庆大霉素敏感，对四环素、红霉素、青霉素、阿奇霉素、氨苄西林和头孢呋辛钠等抗生素耐药。

3 讨 论

1）近年来，随着肉鸽规模化养殖的发展，绿脓杆菌感染的病例屡有报道， 但多数感染发生在成年鸽或幼鸽，并常伴有共感染，而未见2~3 日龄乳鸽大批量感染死亡的报道。 根据临床症状、 乳鸽剖检病变、细菌分离培养和分子生物学鉴定，确定了引起石家庄市某鸽场乳鸽死亡的原因是绿脓杆菌感染。

2）绿脓杆菌广泛存在于土壤、空气和水中以及动物的肠道和皮肤，是一种条件性致病菌。该病的发生虽无明显季节性，但与动物营养状况、饲养环境和应激因素密切相关， 并且该菌在温暖湿润的环境中更容易繁殖。 赵振振等[6]报道了镇江某鸽场因鸽群应激、环境潮湿而引发的绿脓杆菌感染。 苏飞[7]对江苏某市18 日龄雏鸽暴发绿脓杆菌感染进行了报道和有效治疗。此次乳鸽感染发生在夏季多雨季节，潮湿的环境可能是诱发乳鸽感染绿脓杆菌的一个重要因素。 此外，育雏室卫生条件差，没有做好定期通风和消毒为细菌滋生创造了良好条件， 加之乳鸽自身免疫力较弱，体表皮肤无羽毛的保护，极易通过外伤感染绿脓杆菌等条件致病菌。 因此，加强饲养管理，做好环境清洁、卫生和消毒工作，以及避免鸽笼有尖锐物刺伤皮肤等是预防乳鸽绿脓杆菌感染的有效措施。

3）绿脓杆菌对外界环境的抵抗力非常强，对抗生素也容易产生耐药性。 不同地区分离的绿脓杆菌因血清型不同和当地用药情况不同导致对抗生素的耐药性产生差异。有报道称，鸡源绿脓杆菌存在对庆大霉素、新霉素和磺胺类药物产生耐药性的现象。此次分离菌株与已报道的鸽源绿脓杆菌类似， 对环丙沙星、头孢吡肟、阿米卡星、诺氟沙星、氧氟沙星和庆大霉素等抗菌药物敏感。为了避免耐药菌株的出现，在绿脓杆菌的防控中应选择几种高敏药物交替混合使用，这样才能有良好的治疗效果。

表1 绿脓杆菌的药敏试验结果