电针对骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留大鼠尿动力学的影响和机制研究

卢 壮，黄钰岚，阮成志，林 静

广西壮族自治区百色市人民医院康复医学科，广西百色 533000

骶髓损伤(SCI)后引起的神经源性膀胱(NB)是临床最常见并发症之一，指发生于骶段的脊髓损伤，使骶髓初级排尿中枢受损或其周围神经病变而引起膀胱或尿道功能障碍，可导致逼尿肌无反射，临床主要表现为尿潴留[1]。电针疗法具有双向调节膀胱与抗泌尿系统感染的功能[2]，因其疗效确定、无创、操作简便等特点，具有较高的临床应用价值；但其具体作用机制尚未完全阐明。本研究拟选取SD大鼠为研究对象，并建立SCI后NB尿潴留大鼠模型，并就其作用机制进行深入探讨，为医学的推广应用提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 注射用青霉素钠(石家庄石药集团中诺药业公司，国药准字H23020930)；水合氯醛(上海山浦化工有限公司，国药准字30037516)；乳酸钠林格注射液(安徽双鹤药业公司，国药准字H20055488)；TRIzol Reagent(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒(日本Takara公司)；RIPA裂解液(北京索莱宝公司)；BCA蛋白定量试剂盒(北京索莱宝公司)； SDZ-V型电针治疗仪(苏州医疗公司)；WZ-50C6微量灌注泵(浙江史密斯医学仪器公司)；MP150-WSW多通道生理记录仪(美国Biopac公司)；多功能酶标仪(美国MD公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；蛋白转印模块(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(上海天能公司)；所有抗体(英国Abcam公司)。

1.2实验动物和分组 雄性SD大鼠45只，SPF级，体质量250～300 g，由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(桂)2014-0002，质量合格证号：45000300000987。随机挑选10只作为空白组，其余35只大鼠进行SCI手术造模，2周后确定NB模型成功后随机分为模型组、电针组与电针对照组。动物实验过程符合动物伦理委员会标准。

1.3实验方法

1.3.1模型制备 除空白组外，其余3组参照脊髓横断法[3]并加以改良[4]，制作SCI后NB尿潴留大鼠模型。具体操作方法如下：大鼠禁食12 h，于造模前2 h腹腔注射青霉素20万U以预防手术感染。对大鼠进行称重，按30 mg/kg标准使用10%的水合氯醛进行腹腔麻醉，以俯卧位将大鼠固定于鼠板上，剔除术区被毛，碘酊消毒，铺巾，以L2～L3椎间隙为中心纵向切开皮肤(约2 cm)，进行肌肉、筋膜的钝性分离，确定L2～L3棘突及椎板位置，切断棘间韧带并咬除椎板，使用牙科探针横向穿过，挑起并切断脊髓，最后进行止血、常规缝合、术后消毒，皮下注射2 mL乳酸钠林格注射液以预防电解质紊乱和失水。将造模后大鼠进行单笼饲养，保持37 ℃恒温条件，自由进水、进食，每天用Cred′s手法按压膀胱辅助排尿、排便2～3次，每天腹腔再次注射青霉素20万U以预防伤口感染(连用7 d)。成模标准：对造模大鼠进行行为学观察，以出现前肢可行走，后肢处于拖动状态，膀胱膨大，尿潴留等症状判定为建模成功，观察各组大鼠进食、排尿、活动等情况。

1.3.2电针治疗 成功建模后第14天开始进行电针治疗。电针穴位选取次髎(第2骶后孔处直刺约15 mm)、中极(神阙穴与耻骨联合上缘连线的上4/5与下1/5的交点平刺5 mm)、三阴交(后肢内踝尖直上方1 cm处直刺5 mm)，电针对照组则选取这3个穴位的对照点(穴外侧旁开0.3 cm处)，两组针刺法相同[5]。具体操作方法如下：采用SDZ-V型电针治疗仪进行电针刺激，疏波以10 Hz工作5 s，密波以50 Hz工作9 s，保持肢体微颤的强度；电针组针刺双侧次髎时，左侧连正极，右侧连负极；针刺中极和三阴交时，中极连负极，三阴交连正极；另外，针刺三阴交需隔日左右侧交替取穴；电针对照组的操作方法与电针组相同，每日1次，电针时间为20 min，为期7 d[4]。空白组和模型组则不进行电针治疗。

1.3.3标本采集和处理 各组大鼠完成尿动力学检测后，用水合氯醛腹腔麻醉后，取L2～L3椎间隙为中心上下各约1 cm脊髓组织，经生理盐水洗净，-80 ℃保存备用。

1.3.4尿动力学检测 对各组大鼠进行麻醉，排空膀胱，在尿道处导入F3导管，使用微量灌注泵和MP150-WSW多通道生理记录仪，匀速(0.1 mL/min)灌注恒温生理盐水，同时记录膀胱最大容量、膀胱基础压、漏尿点压力、膀胱顺应性。

1.3.5定量PCR 根据GenBank中大鼠HSP20、Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-9、PTEN、FOXO1、β-actin的mRNA序列，使用Primer-BLAST设计PCR引物。按试剂说明书，采用TRIzol试剂分别提取各组大鼠脊髓组织的总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA；然后按照说明书，采用SYBR Green Ⅰ染料法进行定量PCR。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s扩增40个循环；72 ℃延伸10 min，实验步骤均重复3次，结果取平均值，按照2-ΔΔCt法进行数据分析。见表1。

表1 PCR引物序列

1.3.6蛋白质印迹法 取脊髓组织样品50 mg，匀浆后离心取上清液，按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白浓度测定，5×Loading buffer混匀，沸水浴5 min；每泳道上样40 μg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳，切胶，湿法转膜后，5%脱脂奶粉浸泡，室温放置约1 h。将膜和一抗放置于4 ℃冰箱过夜孵育，1×TBST清洗3次，每次10 min；然后用1×TBST稀释的二抗于37 ℃孵育1 h，1×TBST清洗3次，每次15 min；显色曝光后进行底片扫描，统计分析蛋白灰度值。

2 结 果

2.1一般情况观察 35只造模大鼠中，有2只后肢能自主活动，2只手术后死亡，3只不符合造模要求，共30只符合成模标准，最终空白组、模型组、电针组和电针对照组每组10只，纳入结果分析。

2.2电针对SCI后NB尿潴留大鼠尿动力学的影响 针对各组大鼠的尿动力学检测结果显示，与空白组比较，模型组膀胱最大容量、漏尿点压力和顺应性均增加(P<0.05)；与模型组比较，电针组治疗后膀胱最大容量、漏尿点压力和顺应性均降低(P<0.05)；与电针组治疗前比较，电针组治疗后的膀胱最大容量、漏尿点压力和顺应性均降低(P<0.05)；电针对照组与模型组的尿动力学检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，且电针对照组治疗前与治疗后的尿动力学检测结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)；各组的膀胱基础压结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠尿动力学检测结果

2.3电针对SCI后NB尿潴留大鼠HSP20、PTEN表达的影响 采用定量PCR和蛋白质印迹法分别检测各组大鼠脊髓组织HSP20和PTEN的mRNA、蛋白及p-HSP20蛋白相对表达水平，结果显示，与空白组比较，模型组HSP20的mRNA、蛋白及p-HSP20蛋白相对表达水平均降低(P<0.05)，PTEN则升高(P<0.05)；与模型组比较，电针组HSP20的mRNA、蛋白及p-HSP20蛋白相对表达水平均升高(P<0.05)，PTEN则降低(P<0.05)；电针对照组与模型组HSP20和PTEN的mRNA及蛋白相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图1。

表3 各组大鼠脊髓组织的HSP20、PTEN的mRNA相对表达水平结果

注：A表示蛋白质印迹法检测各组的HSP20、p-HSP20和PTEN蛋白相对表达水平；B表示蛋白质印迹法检测各组的HSP20、p-HSP20和PTEN蛋白相对表达水平的统计值;模型组与空白组比较，aP<0.05；电针组与模型组比较，bP<0.05。

相对表达水平结果

2.4电针对SCI后NB尿潴留大鼠Akt活化及凋亡通路的影响 采用定量PCR和蛋白质印迹法分别检测各组大鼠脊髓组织Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-9、FOXO1 mRNA、蛋白及p-Akt蛋白相对表达水平，结果显示，与空白组比较，模型组的Bcl-2 mRNA和p-Akt、Bcl-2蛋白相对表达水平均降低(P<0.05)，Bax、Caspase-9及FOXO1 mRNA和蛋白相对表达水平则升高(P<0.05)；与模型组比较，电针组Bcl-2 mRNA和p-Akt、Bcl-2蛋白相对表达水平均升高(P<0.05)，Bax、Caspase-9及FOXO1 mRNA和蛋白相对表达水平则降低(P<0.05)；各组Akt mRNA及蛋白相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，电针对照组与模型组的Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-9及FOXO1 mRNA和蛋白相对表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表4。

注：A表示蛋白质印迹法检测各组Akt通路凋亡相关因子蛋白水平；B表示蛋白质印迹法检测各组Akt通路凋亡相关因子蛋白水平的统计值;模型组与空白组比较，aP<0.05；电针组与模型组比较，bP<0.05。

因子蛋白相对表达水平结果

表4 各组大鼠脊髓组织的Akt通路凋亡相关因子mRNA相对表达水平结果

3 讨 论

据统计，全球超过100万人患脊髓损伤，而SCI患者中NB的发生率接近100%[6]。该病通常继发反复尿道感染，甚至引起肾衰竭，肾衰竭被认为是脊髓损伤患者死亡的第一诱因[7]。当骶髓受损，神经中枢无法接收膀胱尿道的冲动信号，且无法对尿道外括约肌和膀胱逼尿肌进行有效调控，排尿反射失调，致使膀胱容量增大，压力增加，最终导致尿潴留。尿动力学检测是目前公认的SCI后NB的诊治“金标准”，可客观、准确地反映膀胱储存及排尿功能状态，且有助于疗效评价。次髎属足太阳膀胱经穴，有疏导水液作用，主治小便不利所致的尿潴留；中极乃足三阴和任脉交会穴，利于膀胱功能调节及气化；三阴交则为足三经交会穴，可调节膀胱活动。而电针刺激脊髓神经，可改善腰骶部排尿中枢功能，以及逼尿肌的张力和顺应性，有助于膀胱收缩活动，促进膀胱功能的恢复。李小龙[8]采用电针次髎对45例脊髓损伤患者进行治疗，发现该法有助于尿意和便意恢复，对非自主漏尿有明显疗效，可明显改善排便时间频率。曾莹洁等[9]的研究发现，电针治疗脊髓损伤后NB兔14 d后，相较于模型组，电针组最大膀胱测量容量和膀胱最大逼尿肌压力得到了明显改善。李景兴[4]的研究证实针刺次髎、中极、三阴交可一定程度修复受损膀胱组织，是应用有效且科学的主穴。

本研究进行SCI后NB尿潴留大鼠建模发现，建模成功的大鼠膀胱最大容量、漏尿点压力和膀胱顺应性明显增高，说明骶髓排尿中枢受损后，逼尿肌无力，括约肌松弛，膀胱容量不断增大，可导致明显的尿潴留症状。应用电针取穴次髎、中极、三阴交治疗建模大鼠后发现，膀胱最大容量、漏尿点压力和膀胱顺应性均降低，与既往研究结果一致，表明电针可明显改善腰骶部排尿中枢功能，提高膀胱逼尿肌弹性，一定程度恢复逼尿肌反射及维持正常的收缩功能，降低膀胱最大容量和减少残尿量，改善尿潴留大鼠膀胱功能，进一步证实了电针治疗SCI后NB的有效性。

SCI可导致脊髓组织细胞凋亡，进而影响膀胱功能的恢复。研究发现，电针刺激SCI后NB大鼠的次髎、中极、三阴交，可激活P13K/ Akt信号通路，抑制细胞凋亡，从而发挥对受损膀胱组织的修复作用[10]，但机制尚未阐明。脊髓损伤状态下，会产生应激反应，而热休克反应是一种重要的应激反应。研究已证实，HSP70蛋白过表达可与神经生长因子产生协同作用，抑制细胞凋亡，保护脊髓损伤组织[11]。而研究发现，HSP20过表达能促进Akt的活化[12]，并与Bax表达和Caspase级联效应有关[13]，从而保护细胞损伤引起的凋亡[14]。此外，PTEN是重要的抑癌因子，PTEN/Akt信号通路在生长因子受体信号传递、调控基因表达、防止细胞凋亡等方面发挥重要作用。YOSUKE等[15]研究表明，PTEN蛋白能通过抑制Akt通路，影响下游靶基因表达，参与神经干细胞的调控，阻碍脊髓损伤后神经组织的修复。抗凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子Bax是常见的Akt通路下游调控因子。除此之外，Caspase家族是调控细胞凋亡的关键执行者，受不同信号通路激活后调节肿瘤细胞的增殖和凋亡；其中，Caspase-9可通过激活Caspase-3表达，诱导细胞凋亡，并受Akt调控[16]。Akt的重要靶点之一是FOXO蛋白家族的转录调控子，FOXO1作为Akt的底物，是一种生长衰减和促凋亡蛋白，具有控制新陈代谢和调节细胞凋亡的作用。

本研究发现，SCI后NB尿潴留大鼠的脊髓组织中p-Akt相对表达水平降低，而电针治疗后的p-Akt相对表达水平明显升高，与既往报道一致，表明骶髓中枢受损后，Akt通路受到抑制，而电针刺激骶髓神经可增强Akt活性，促进Akt通路。同时发现，在应用电针治疗后，大鼠脊髓组织中HSP20的相对表达水平明显升高，PTEN的相对表达水平明显降低，表明HSP20相对表达水平升高和PTEN相对表达水平降低可增强Akt活性，提示电针的作用机制与HSP20、PTEN的表达密切相关。本研究还进行了Akt下游凋亡相关因子的检测，发现电针治疗后Bcl-2的mRNA和蛋白相对表达水平升高，而Bax、Caspase-9及FOXO1的相对表达水平明显降低，表明电针治疗后，Akt活性增强，进而影响下游Bcl-2、Bax、Caspase-9和FOXO1的表达，抑制细胞凋亡。

由此可推测，SCI后引起NB发生后，可促进细胞凋亡，阻碍神经组织修复，进而影响脊髓和膀胱功能，使膀胱无法正常排尿，导致尿潴留；而电针治疗，可促进HSP20表达及磷酸化，抑制PTEN表达，进而促进Akt活性，促进下游Bcl-2和抑制Bax、Caspase-9和FOXO1等凋亡因子的表达，抑制细胞凋亡，从而导致部分脊髓神经功能的恢复，进一步提高神经中枢对膀胱组织的调控，维持正常的逼尿肌和括约肌功能及膀胱内压，改善膀胱收缩及排尿功能，降低膀胱最大容量、漏尿点压力和膀胱顺应性，减少残尿量，逐渐减轻尿潴留症状。

综上所述，电针次髎、中极、三阴交可改善SCI后NB尿潴留大鼠膀胱功能，其调控机制可能与HSP20和PTEN对Akt通路及Bcl-2、Bax、Caspase-9和FOXO1等凋亡相关因子表达有关。提示电针疗法可作为临床上治疗SCI后NB患者的重要手段之一，对临床应用及中医学的推广具有重要的意义。