九里香总RNA的提取及类黄酮O-甲基转移酶基因生物学分析

徐红红 黄世稳 梁凌玲

摘 要：生活在我国西南部的植物九里香具有解毒消肿等多种功效，是我国一类常用的中草药材，其中O-甲基类黄酮因其酮含量高，稳定且利用率高等原因成为九里香中主要的功能成分之一，本实验通过对类黄酮具有催化作用的O-甲基转移酶基因进行实验，为基因的特点及功能做进一步分析，并通过对九里香的RNA提取为该基因的后续克隆做准备。同时利用现代生物学软件对类黄酮O-甲基转移酶基因进行生物学分析，为该基因的后续表达研究做奠定基础。

九里香（Murraya exotica）又名九秋香，为芸香科（Rutaceae）九里香属（Murraya）植物，主要分布于我国广西、贵州等温热地区，有解毒消肿、行气活血、麻醉止痛等功效，其中酮类化合物是其重要的药用价值所在，其中多羟基黄酮类化合物和黄酮苷类化合物，相对于类黄酮的脂溶性及水溶性较差，导致其利用率及应用受到限制，经甲基分子修饰过的类黄酮化合物无论在脂溶性还是水溶性方面都更好，生物利用度也更高[2-3]，本实验将对O-甲基修饰的类黄酮转移酶基因进行进一步的分析。

1.材料和方法

1.1植物采集

植物采集于广西省百色市右江区内提取茎、叶片等部分保存在液氮中备用进行总RNA的提取。

1.2改良的SDS法提取总RNA

（1）将材料迅速放入预冷的研钵里，并加入少量VC作为植物抗氧化剂，不断研磨直至成粉末状倒入管中;（2）向管中分别加入320?L氯仿、320?L Tris-酚和720?L SDS溶液制成懸液，震荡12min后，11000r/min离心8min;（3）吸取上清液至新离心管中，分别加入320?L氯仿和320?L Tris-酚，震荡8min后12000r/min离心8min;（4）重复上一步;（5）吸上清液加入同样体积的氯仿溶液，震荡8min后离心8min;（6）再次吸上清液，向管中加入一半体积的LiCl溶液和一半体积的无水乙醇，摇匀后于-20℃静置40min，13000r/min离心20min，留沉淀;（7）将沉淀在75%乙醇溶液中洗涤2次，晾干至无味，溶解于DEPC水溶液 -80℃保存;（8）利用核酸浓度检测仪检测总RNA的浓度并用1.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

1.3 类黄酮O-甲基转移酶基因的信息学分析

通过NCBI 软件比对，没有发现对九里香该基因的研究，因此选择了同源性较高的大豆类黄酮O-甲基转移酶基因（ID 114422719）进行分析，为后续的九里香该基因的克隆奠定基础，分别利用了NCBI的BLAST检索软件分别对大豆类黄酮O-甲基转移酶基因的开放阅读框和氨基酸序列同源性比对进行分析（基因序列为图1-1）;运用ProtParam软件预测该基因的基本理化性质;利用ProtScale软件预测基因编码蛋白的亲疏水性分析;利用PSORTII Prediction软件对蛋白质的亚细胞定位和功能进行预测;蛋白质三级结构和系统发育树的构建由SWISS-MODEL和NCBI中blast比对软件完成。

2.实验结果

2.1九里香总RNA的提取

九里香中普遍含有酚类、固醇类、萜类等代谢产物，所以提取总RNA过程较为困难，因此通过多次实验最终通过改良后的SDS法进行提取，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳方法进行检测。

2.2类黄酮O-甲基转移酶基因的信息学分析

2.2.1.基因的基本理化性质

利用ProtParam软件对类黄酮O-甲基转移酶基因进行理化性质分析，该基因全长1711 bp，ORF长901 bp，共编码283个氨基酸，相对分子质量为31 kD，理论等电点为6.07，其中负电荷残基数为30，正电荷残基数为26，不稳定系数为39.88<40，表示该蛋白为稳定性蛋白。

2.2.2类黄酮O-甲基转移酶基因的亲疏水性分析

基因的亲疏水性表明氨基酸的第251位的疏水性最高，氨基酸的第1251位的为亲水性最低，由图可知该蛋白的疏水性氨基酸明显多于亲水性氨基酸，因此类黄酮O-甲基转移酶蛋白为疏水性蛋白。

2.2.3类黄酮O-甲基转移酶的亚细胞定位及功能预测

利用NetPhos2.0软件对蛋白的亚细胞进行定位，发现该蛋白定位于细胞质的几率为69.6%，定位于核能的几率为13.0%，定位于线粒体的几率为8.7%，定位于分泌系统囊泡和液泡的几率为4.3%，说明该基因编码的蛋白主要存在于细胞质中，常以二聚体形式存在，并催化类黄酮的的O-甲基化反应，与豆科植物的固氮作用有关。

2.2.4类黄酮O-甲基转移酶蛋白三级结构预测

通过SWISS-MODEL软件对蛋白进行三级结构预测，如图2-4所示，蛋白的立体结构为无规则卷曲。

2.2.6类黄酮O-甲基转移酶蛋白系统发育树

通过NCBI软件中BLAST同源性比对将发现该基因的同源性较强，其中主要与大豆，野葛根，菜豆紫花苜蓿和花生的类黄酮O-甲基转移酶基因同源性最高。

3.结果分析

总RNA提取质量的好坏是基因克隆实验的基础，也是最重要的步骤之一，提取的结果将直接影响到后续的克隆实验的成败。本实验通过对SDS法进行改良成功提取了九里香总RNA，结果显示28sRNA和18sRNA条带清晰完整，且第一条带的亮度约为第二条带亮度的2倍，通过过核酸蛋白浓度检测，A260/A280比值为1.96，结果介于1.8-2.0之间，说明提取的总RNA相对纯度较高，可以利用和保存用于后续的克隆实验。生物信息学是融合多种学科的理论及应用方法而产生的综合分析学科 [4]，本实验利用信息学软件对大豆类黄酮O-甲基转移酶基因的分析发现，发现该基因与野葛根、菜豆、紫花苜宿、花生等多种植物的O-甲基转移酶基因有高同源性，根据基本理化性质、三级结构、亲疏水性等多种性质进行分析，结果表明该基因全长1711bp，开放阅读框长901bp，理论等点点为6.07，说明类黄酮O-甲基转移酶为中性蛋白，相对分子质量（Mr）为31 kD，为稳定性蛋白，且疏水性很强。蛋白二级结构发现该蛋白主要以螺旋和卷曲组成，三级立体结构分析该蛋白呈现卷曲状，通过生物信息学分析，该基因主要是通过是催化S-腺苷甲硫氨酸中的甲基转移到类黄酮的羟基上，从而增加其稳定性和脂溶性，是植物体内重要的次生代谢产物之一。

参考文献

[1]茶树类黄酮 O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析马成英，吕海鹏，林智，中国农业科学2013，46（2）：325-333

[2]Zhou DaYong，Zhang Xiu Li.UPLC /Q-TOFMS /MS as a powerful technique for rapid identification of polymethoxylated flavones in Fructus Aurantii[J].J Pharm Biomed Anal，2009（ 50）： 2.

[3]涂华，陈碧琼，张燕军.天然类黄酮物质的提取工艺研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2011，17 （6） ： 277.

[4]安曼云.药用植物基因资源的生物信息学研究[J]建筑实践，2019，38，（17）