2种显色培养法与PCR法检测B族链球菌的效能比较

杜海燕，钟 欣，谭延国，张 岩，杜金龙，唐春燕，刘淑梅

(首都医科大学附属复兴医院检验科,北京 100038)

B族链球菌(GBS)，也称无乳链球菌，以其细胞壁多糖类C物质属于Lancefield抗原结构分类中的B群而得名[1]。GBS为寄生于人类下消化道或泌尿生殖道的条件致病菌,在围生期常导致孕产妇生殖道感染、严重的新生儿感染甚至死亡，因此围生期妇女需要产前常规筛查GBS，以保证母婴的健康，且此建议已被写入相关学科的指南和专家共识。目前，常用筛查GBS的方法有传统微生物学培养法、显色培养法和分子生物学方法等，但只有对这些检测方法的效能有了深入的认知，方可做出正确地选择，以便更有效地筛查出GBS感染者。本文使用GBS标准菌株和临床分离株，对2种显色培养法及PCR法检测GBS的效能进行了评估，现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株及试剂

1.1.1GBS菌株 GBS国际标准菌株(ATCC 12386)及从临床患者分离并经质谱仪鉴定的20株GBS测试菌株。

1.1.2干扰试验菌株 白色念珠菌(ATCC 24433)、大肠埃希菌(ATCC 25922)、粪肠球菌(ATCC 29212)共3株。

1.1.3GBS显色增菌培养基 凯必利GBS显色培养基(杭州创新生物技术有限公司，A试剂)、贝索GBS显色培养基(珠海贝索生物技术有限公司，B试剂)，按说明书要求，以培养18～24 h出现橘红色的颜色变化为阳性。

1.1.4PCR法GBS检测系统 中山大学达安基因股份有限公司的GBS核酸检测试剂盒和扩增仪(DA-7600)，结果判读以循环阈值(Ct)<38为阳性，Ct≥38为阴性。增菌后的GBS使用哥伦比亚培养基(英国OXOID)进行分离培养。

1.2方法 主要评估各种方法能够检测出GBS的最低菌落数(即检测下限)、对20株临床GBS分离株的检出能力、抗模拟肠道菌干扰的能力等。

1.2.1各种方法能够检测出GBS的最低菌落数 (1)以系列稀释的GBS标准菌株评估。首先，将标准菌株转种到哥伦比亚培养基，于35 ℃培养18～24 h。挑取菌落配成0.5麦氏浊度菌液(1.5×108CFU/mL)。用无菌生理盐水10倍系列稀释为8个浓度，见表1。(2)稀释后的各浓度菌悬液分别按表1中的吸取量接种到哥伦比亚培养平板(每个浓度菌液平行接种3个平板)，置35 ℃培养18～24 h计数菌落，以验证加入的菌落数是否符合预期。(3)分别取上述各浓度的菌液0.01 mL，接种在A、B显色培养基,于35 ℃分别培养6、12、18、24、30 h，于每个时间点观察培养基的颜色变化并记录，每个浓度重复3次；同步使用PCR方法，测定上述各浓度菌液。(4)于每个观察时间点从两种显色培养基中吸取0.01 mL菌液接种于哥伦比亚培养平板，观察是否出现GBS的典型菌落。

表1 标准菌株稀释表

1.2.2各种方法对20株临床GBS分离株的检出能力 将20株GBS临床分离株分别配置成1.5×106CFU/mL的菌悬液。每个菌株分别加入0.01 mL(实际加入菌落数为1.5×104CFU)上述菌悬液于A、B(A试剂、B试剂)2种显色培养基，35 ℃培养18～24 h观察颜色变化。同时使用PCR法测定上述菌悬液，并观察3种方法的检出情况。显色法培养18～24 h，观察颜色变化后，再吸取0.01 mL，接种于哥伦比亚平板，用以确认有无GBS生长。

1.2.3各种方法检测GBS的抗干扰能力 使用模拟的肠道菌悬液，观察是否能够干扰几种方法对GBS的检测。分别取白色念珠菌(ATCC 24433)、大肠埃希菌(ATCC 25922)、粪肠球菌(ATCC 29212)标准菌株，按菌量为1∶1∶1的比例，配置成1.5×103CFU/mL模拟肠道菌悬液。取1.5×103CFU/mL的上述菌液0.1 mL，分别加入A、B 2种显色培养管中培养(分别已接种有1.5×103CFU、1.5×102CFU和15 CFU的GBS标准菌株)。置35 ℃培养，并分别于6、12、18、24、30 h观察颜色变化和记录结果。本实验重复测定3次。

1.3统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1几种方法能够检测出GBS的最低菌落数

2.1.1预期加入的菌落数验证 6号菌液预期加入菌落数为15 CFU，实际加入菌落数为50 CFU左右，而7号和8号菌液与预期菌落数接近。见表2。

表2 系列稀释的标准菌株菌悬液菌落计数验证试验

2.1.2几种方法检出GBS的最低菌落数 (1)A试剂显色培养法：8个浓度的标准菌液分别接种到8个增菌培养管中，培养18 h，第1次试验1～8号均为阳性；重复第2次培养18 h时，1～6号均为阳性，7～8号培养30 h时，仍为阴性；重复第3次培养18 h时，1～6号均为阳性，7～8号为弱阳性，培养24 h和30 h时，7～8号均转为阳性。(2)B试剂显色培养法：第1次试验培养18 h时，1～7号均为阳性，8号培养30 h时，仍为阴性；第2次培养18 h时，1～8号菌液均为阳性；第3次培养18 h时，1～8号均为阳性。随后对7～8号标准菌液加做了补充试验，每个浓度A、B两种增菌培养试剂均分别做10管，结果7、8号标准菌液的10个测试管培养18 h时，均判定为阳性。故可得出A、B两种显色培养基可检出GBS的最低加入菌量为15 CFU。(3)PCR法检测 3次重复试验显示，1～3号标准菌液均为阳性；4号标准菌液仅1次Ct值超出cut-off值(Ct值=38.11>38)，判定为阴性，5～8号标准菌液均无扩增信号。故可得出PCR法可检出GBS的最低加入菌量为1.5×104CFU。见表3。

表3 PCR法能够检出GBS的最低菌量

2.2各种方法对20株临床GBS分离株的检出能力 20株临床GBS分离株在加入3种检测试剂时，加入菌落数为1.5×104CFU时，A、B两种显色培养基所接种的20株菌均为阳性；PCR法仅有11株菌为阳性，另3株虽小于cut-off值，但仍有扩增信号。经χ2检验，两种显色法的检出率均明显高于PCR法，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 显色培养法和PCR法对20株临床GBS分离株检出能力比较(加入菌量为1.5×104 CFU时)

2.3模拟肠道菌对3种方法的干扰 A、B试剂(分别加入1.5×103、1.5×102、15 CFU的GBS菌液)，在分别加入1.5×102CFU模拟肠道菌后所重复的3次试验中，2种试剂仅加入15 CFU的GBS时出现1次显色被延迟至24～30 h，而未加干扰菌时，该浓度均在增菌培养18 h后出现清晰的显色反应。而2种试剂其余各浓度均于培养18 h显色明显，而仅加入模拟菌液的对照组则均呈阴性反应。由于上述GBS加入菌液浓度过低，使用PCR法检测时均为阴性反应。

3 讨 论

GBS多定植于健康成年人的下消化道和泌尿生殖道，人群定植率为15%～30%。当免疫力低下或缺陷时，易发生GBS感染[2-3]。对于围生期孕妇来说，GBS的危害远高于非妊娠女性。孕妇一经感染，除可引起孕妇胎膜早破、早产和产后产褥感染外，还会导致新生儿发生肺炎、败血症、脑膜炎、神经系统后遗症，甚至死亡[4-5]。此外，GBS具有较强的绒毛膜穿透力，可感染胎盘绒毛膜，从而进一步感染新生儿[6-9]。因此，选择可靠的GBS检测方法，尽可能地发现携带GBS的孕妇具有重要意义。

本研究使用的两种GBS增菌显色培养法，经过18～24 h的增菌培养，均可检出最低达15 CFU的加入量，具有较高的灵敏度。该方法利用的是GBS具有产生橙色(橘红色)类胡萝卜素的独有特性，液体培养基相对于固体培养基，微生物接种的成活率和繁殖效率均较高，培养基从白色到橙色的变化表示GBS的存在，菌落数量培养基中还加入了促进GBS快速生长和抑制其他杂菌生长的物质，这也是这种方法能够测出较少菌落数量和较短培养时间的关键所在。PCR法可以通过检测标本中GBS特定基因，从而判断GBS的存在，理论上具有较高的灵敏度和准确度及报告时间快等，但本研究显示其最低只能够检测出1.5×104CFU的加入量。这可能与不同厂商的生产工艺有关，故无论使用任何一种方法，投入使用前均需进行必要的性能验证。

GBS增菌显色培养法对20株临床分离株的检出能力较为稳定，受所加入菌落数影响较小；显色培养12 h时，各种GBS加入量的培养基便陆续出现轻微的颜色变化，在18 h后均能出现稳定颜色反应，而PCR法则随着加入GBS 菌落数的降低，检出能力降低很明显，这会明显影响临床孕产妇GBS的检出率，但对处于未知GBS定植状态且没有其他危险因素的足月孕妇，可能更适用PCR法[10-13]。

本研究结果还显示，仅加入15 CFU的GBS时，模拟肠道菌会偶尔导致显色时间被延迟的现象，故建议在18～24 h未出现显色反应的标本，可适当增加判读时间至30 h。

4 结 论

综上所述，显色培养法能够检测出更少菌落数的GBS，有助于提高孕妇产前GBS的检出率，由于其操作简便、结果易于判读，值得推广应用。