快速水蒸气蒸馏-气相色谱热能分析仪法测定肉制品和水产制品中13种N-亚硝胺

马兴，肖亚兵，陈颖，周磊，赵友全

（1.天津海关动植物与食品检测中心，天津300461；2.上海海关，上海200002；3.天津海关工业产品安全技术中心，天津300461；4.天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津300072）

N-亚硝胺类化合物是由胺类前体物质与亚硝酸盐在一定条件下反应生成[1-3]。N-亚硝胺化合物众多，常见的种类有N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamin，NDMA）、N-二乙基亚硝胺（N-methyl-N-nitrosoethylamin，NDEA）、N- 二 丙 基 亚 硝 胺 （N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-二苯基亚硝胺 （N-methyl-N-phenylnitrous amide，NDPhA）、N-亚硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）和N-亚硝基吗啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）等。N-亚硝胺是国际公认的毒性较大的污染物，研究显示N-亚硝胺化合物可导致某些癌症发病率升高[4-5]，具有肝毒性[6-7]。对人类而言，吸烟是N-亚硝胺摄入的主要途径；饮食和食品接触材料中N-亚硝胺化合物迁移和溶出则是非吸烟人群的主要摄入途径[8-9]。目前，我国国家标准GB 2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》[10]规定肉制品和水产制品中NDMA的限量标准分别为3.0 μg/kg和4.0 μg/kg，尚未给出其它N-亚硝胺化合物的限量要求。

N-亚硝胺化合物的检测方法众多，主要包括气相色谱-热能分析仪法（gas chromatography-thermal analyzer，GC-TEA）[11-12]，气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[13-14]，气相色谱-串联质谱法（gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[15-16]，液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[17-18]，高效液相色谱-荧光检测法（high performance liquid chromatography with fluorescence detection，HPLC-FD）[19]等。美国公职化学家协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）和国际癌症研究机构（International Agency for Research on CancerI，IARC） 对各种方法综合评价后认为，食品中N-亚硝胺分析的最好方法是GC-TEA。在国家标准中，气相色谱-热能分析仪法（GC-TEA）也被列为亚硝胺检测方法之一[20]。食品样品基质复杂，N-亚硝胺化合物限量要求苛刻，样品前处理是检测中的关键和难点。国内外标准检测方法多采用水蒸气蒸馏提取，虽然具有适用性强和有效控制基质效应的优点，但是传统水蒸气蒸馏时间较长，稳定性差，严重影响检测效率。研究人员尝试采用较为先进的固相萃取[21]，分散液液微萃取[22]和快速样品前处理技术（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe，QuEChERS）[23]等前处理方法作为改进，但是NDMA检出限难以满足限量要求。

本研究使用课题组自主研发的快速水蒸气蒸馏仪处理样品，检测过程中采用N-亚硝基二异丙胺（N-nitrodiisopropylamine，NDiPA）作为内标，GC-TEA 法检测分析肉制品和水产制品中N-亚硝胺化合物。快速水蒸气蒸馏仪的使用，可以将水蒸气蒸馏处理时间缩短至25 min，且水蒸气蒸馏过程无需专人值守，达到设定蒸馏体积后自动关停，节约了人力，提高了前处理效率。采用NDiPA作为内标，可有效修正浓缩过程中N-亚硝胺化合物的流失比例，提高了检测的稳定性，保证了良好的方法回收率。

1 材料与方法

1.1 仪器试剂

1.1.1 仪器

GC 200型气相色谱仪、TEA 810型热能分析仪：英国Ellutia公司；水蒸气蒸馏仪：天津大学精仪学院与天津海关动植物与食品检测中心合作研发；Value HL G3型旋转蒸发仪：德国Heidolph公司；ME2002E型电子天平（感量0.01 g）：瑞士梅特勒-托利多公司；CM-24-001型氮吹仪：北京成萌伟业公司；SIMF140LADL型制冰机：日本松下公司；DB-WAX型毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm×0.50 μm）：美国安捷伦公司。

1.1.2 试剂

二氯甲烷（CH2Cl2）、氯化钠（NaCl）、无水硫酸钠（Na2SO4）、浓硫酸（H2SO4）、无水乙醇（C2H5OH）：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

N-亚硝胺混合标准品 [包含NDMA、NMEA、NDPA、N-亚硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亚硝基二异丁胺（N-diisobutylnitrosamine，NDiBA）、N-亚硝基二正丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亚硝基哌啶（N-nitrosopiperidine，NPIP）、N-亚硝基吡咯烷（NPYR）、N-亚硝基吗啉（NMOR）、N-亚硝基-N-甲基苯胺（N-methyl-N-phenylnitrous amide，NMPhA）、N-亚硝基-N-乙基苯胺（N-ethyl-N-phenylnitrous amide，NEPhA）、N-亚硝基二异壬基胺（N-nitroso-N，N-di-（7-methyloctyl）amine，NDiNA）、N-亚硝基二苄胺 （N-nitrosodibenzylamine，NDBzA），1 000 mg/L，纯度≥99.0%]、N-亚硝基二异丙胺（NDiPA，1 000 mg/L）：纯度≥99.0%，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 标准储备液配制

N-亚硝胺化合物混合标准储备液：移取200 μL亚硝胺混合标准溶液至100 mL容量瓶中，用乙醇配制成浓度为2.0 μg/mL的混合标准储备液，冷藏避光保存。

内标标准储备液（N-亚硝基二异丙胺）：移取100μL亚硝胺混合标准溶液至100mL容量瓶中，用乙醇配制成浓度为1.0 μg/mL的内标标准储备液，冷藏避光保存。

1.3 标准工作溶液的配制

将混合标准储备液放至25℃，分别移取0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL N-亚硝胺化合物混合标准储备液和1.0 mL内标标准储备液于10mL容量瓶中，用乙醇配成浓度分别为 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00μg/mL 的混合标准系列工作液，其中内标质量浓度为0.10 μg/mL，冷藏避光保存。

1.4 样品处理

准确称取匀质待测样品200.00 g（精确到0.01 g），置于1.0 L蒸馏管中，加入100 mL水和50 g氯化钠，充分混匀并加入100 μL内标标准储备液，然后迅速连接至快速水蒸气蒸馏仪。在500 mL平底烧瓶中加入100 mL二氯甲烷和少量冰块，用以接收馏出液，冷凝管出口伸入吸收液液面以下。在快速水蒸气蒸馏仪工作程序中设置馏出液收集量为300 mL，并启动程序。

蒸馏完成后，向平底烧瓶中加入20g氯化钠和3mL的硫酸，搅拌使氯化钠溶解，然后将溶液转移至分液漏斗进行液液萃取，收集二氯甲烷层，并用150 mL二氯甲烷反萃水层3次，合并有机相，用无水硫酸钠脱水。将二氯甲烷溶液置于蒸馏瓶，加入1.0 mL无水乙醇，用旋转蒸发仪浓缩至5 mL～10 mL后，转氮吹继续浓缩至1 mL，摇匀后待测。

1.5 GC-TEA工作条件

色谱柱为DB-WAX，进样口温度为250℃。程序升温条件：初始温度60℃，保持1 min，以15℃/min速度升温到82℃，保持0 min，以1℃/min速度升温到88℃，保持0 min，以15℃/min速度升温到140℃，保持7 min，最后以20℃/min速度升温到250℃，保持6 min。进样方式为不分流进样，流速为1 mL/min，载气为氮气（≥99.999%），进样体积为2 μL。热能分析仪接口温度设定为250℃，热解室温度设定为500℃。

1.6 数据处理

试验数据为2次重复，结果以平均值表示。采用Microsoft Office Excel 2010软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 水蒸气蒸馏仪构造及工作效果

项目组自主研发快速水蒸气蒸馏仪结构如图1所示。

图1 快速水蒸气蒸馏的结构示意图Fig.1 Structure of rapid steam distillation

与传统水蒸气蒸馏仪相比，主要有以下改进：①大反应瓶容量，高水蒸气产生量，蒸气量可按需调节，至少能够满足200 g食品样品的水蒸气蒸馏前处理；②首次采用内置冷凝循环机代替自来水冷凝，冷凝温度可控范围达-20℃～25℃，节水节能；③接液瓶内置质量传感器、定时器，可通过该设计间接监测体积蒸馏终点和时间蒸馏终点，而传统水蒸气蒸馏多采用时间蒸馏终点，无法与国标体积蒸馏终点要求相匹配；④采用珀尔帖降温技术为接液瓶降温，可保证接液瓶处于低温状态下，防止有机相挥发。同时采用本文所述快速水蒸气蒸馏仪和传统水蒸气蒸馏装置处理鱼干样品，并用GB 5009.26-2016《食品安全国家标准食品中N-亚硝胺类化合物的测定》测定其中N-二甲基亚硝胺含量，结果如表1所示。

表1 不同水蒸气蒸馏提取方法比较Table 1 Comparison of different steam distillation methods

通过表1可以看出，采用传统水蒸气蒸馏装置进行样品前处理平均蒸馏时间为85 min，而采用快速水蒸气蒸馏仪平均蒸馏时间仅需15 min，工作效率提高了5倍；对同一样品进行6次重复检测，与传统水蒸气蒸馏装置相比，快速水蒸气蒸馏仪进行样品前处理所得数据精密度有明显改善。

2.2 色谱柱选择

13种N-亚硝胺化合物分子量和极性差异较大。方法研究过程中考察了N-亚硝胺化合物在安捷伦DB-WAX毛细管色谱柱上的色谱行为，色谱柱规格均为 30 m×0.32 mm×0.50 μm。13种 N-亚硝胺和内标物的色谱图见图2。

图2 13种N-亚硝胺和内标物的色谱图Fig.2 Chromatogram of 13 N-nitrosamines and internal standard

从图2可以看出，N-亚硝基甲基乙胺和N-亚硝基二乙胺，N-亚硝基二正丁胺、N-亚硝基哌啶和N-亚硝基吡咯烷等分子量相近的色谱峰均能够完全分开，有效避免干扰。因此，后续试验采用DB-WAX毛细管色谱柱对N-亚硝胺类化合物进行分离。

2.3 内标法与外标法效果比较

采用GB 5009.26-2016《食品安全国家标准食品中N-亚硝胺类化合物的测定》开展食品中N-亚硝胺类化合物的测定试验主要有两个难点：一是传统玻璃制水蒸气蒸馏装置操作繁琐，稳定性不好，导致精密度实验效果不佳；二是二氯甲烷萃取液经旋转蒸发浓缩时温度和压力控制不好，使得N-亚硝胺化合物流失，导致回收率偏低。为有效改善回收率偏低的现象，本方法开发过程中，同时利用内标法（NDiPA）和外标法进行线性拟合，对空白样品中13种N-亚硝胺化合物的回收率进行了计算，如表2所示。

表2 内标法与外标法回收率和精密度结果比较（n=6）Table 2 Comparison of recovery and precision results between internal standard method and external standard method（n=6）

续表2 内标法与外标法回收率和精密度结果比较（n=6）Continue table 2 Comparison of recovery and precision results between internal standard method and external standard method（n=6）

结果显示：外标法定量的回收率为53%～85%，且集中在低回收率端；而内标法定量的回收率为82%～113%，精密度在2.57%～7.19%之间，说明内标法能够更好地减少蒸馏、萃取、浓缩、氮吹等处理过程带来的误差，保证了定量结果的准确性，有效提高了回收率，提高了结果的精密度。

2.4 方法线性关系、检出限和定量限

在优化的试验条件下，对 0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL系列质量浓度的混合标准系列溶液进行测定。以13种N-亚硝胺化合物与内标物峰面积比为纵坐标（y），以标准溶液质量浓度为横坐标（x），获得线性相关方程。线性相关系数均大于0.995，表明13种 N-亚硝胺化合物在 0.02 μg/mL～1.00 μg/mL 范围内有良好的线性关系。当取样量为200.00 g时，以信噪比（S/N）为3确定13种N-亚硝胺化合物的检出限为0.05 μg/kg～0.18 μg/kg，以信噪比（S/N）为 10 确定13 种N-亚硝胺化合物的定量限为 0.17 μg/kg～0.59 μg/kg，具体结果见表3。

表3 13种N-亚硝胺化合物的线性方程、相关系数、检出限及定量限Table 3 Linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 13 N-nitrosamines

2.5 准确度和精密度

选定不含目标化合物的鱼干、牛肉干、腊肉3种空白样品，进行3梯度6平行添加回收试验，用以考察本方法的准确度和精密度，结果列于表4。

表4 13种N-亚硝胺化合物的回收率和精密度（n=6）Table 4 Recovery and precision of 13 N-nitrosamines（n=6）

续表4 13种N-亚硝胺化合物的回收率和精密度（n=6）Continue table 4 Recovery and precision of 13 N-nitrosamines（n=6）

可以看出，13种N-亚硝胺化合物的平均加标回收率范围为80.1%～112.9%，相对标准偏差为1.88%～7.16%（n=6），方法的准确度和精密度符合实际检测需求。

2.6 实际样品测定

应用本方法检测了超市和电商渠道采集的鱼干、腊肉、牛肉干、虾皮4类共计16个商品，每类商品样品量为4个。其中，有8个样品检出含有N-亚硝胺化合物，2个样品NMDA含量超过国家限量标准，分别是散装即食鱼片和散装咸虾皮，结果列于表5。

表5 实际样品中13种N-亚硝胺化合物含量Table 5 Content of 13 N-nitrosamines in actual samples

续表5 实际样品中13种N-亚硝胺化合物含量Continue table 5 Content of 13 N-nitrosamines in actual samples

结果显示，4类样品中均有NMDA检出，其中鱼干中检出数值最高，虾皮和腊肉次之，牛肉干中最低，其它种类N-亚硝胺化合物偶有检出，含量较低。在鱼片和虾皮中，生鱼片NMDA含量低于即食鱼片，淡干虾皮中NMDA含量低于咸虾皮，说明腌制等加工过程促进了NMDA的形成[24]。腊肉比牛肉干中NDMA含量高，可能与腊肉中脂肪含量较高[25]以及熏制加工方式有关[26]。

3 结论

本研究建立了快速水蒸气蒸馏提取，结合气相色谱-热能分析仪检测肉制品和水产制品中13种N-亚硝胺化合物的方法。快速水蒸气蒸馏提取过程仅需25 min，大大提高了检测效率，提高了试验的稳定性，改善了方法的精密度。终点自动控制技术使蒸馏过程实现了无人值守操作，节约人力。内标法的采用减少了蒸馏、萃取、浓缩过程所带来的误差，提高了方法的回收率。本方法重现性好，定性定量准确度高，测量下限满足肉制品和水产制品中NDMA国家限量要求，是对国标方法的有效改进。