桂花树叶多糖提取及抗氧化活性研究

李建凤，廖立敏，*

（1.内江师范学院化学化工学院，四川内江641100；2.“果类废弃物资源化”四川省高等学校重点实验室，四川内江641100）

桂花树是我国常见的一种木樨科木樨属植物，这种芳香花卉是我国比较珍贵的特产。桂花树一年四季都有绿色的叶子，生态效益非常好，经济价值及观赏价值极佳。桂花树不仅作为一种优良的园林树种被用来美化和绿化环境，还在香料、食品和医药等方面被加以利用[1]。桂花树叶中含有丰富的碳水化合物、脂肪类、蛋白质类等成分，此外还含有多糖、多肽、酚类、黄酮类化合物等多种活性物质。来自于植物组织中的多糖，如绿茶多糖[2]等具有多重生理功效而被研究者重视，例如具备抗氧化、提高免疫、抵抗肿瘤、抵抗病毒、防止凝血以及降低血糖等生物活性和功能[3-4]，作为添加剂广泛应用于各种保健品、食品、功能饲料中。随着科学技术的发展和人们对健康需求的增长，人们对多糖的研究越来越深入[5-7]。目前对桂花树的研究侧重在环境美化方面，桂花树叶有效成分提取方面的研究还未引起人们足够的重视。

目前提取植物中有效成分的方法主要有超声波法[8-11]、微波法[12-14]、酶法[15-17]、溶剂提取法[18-20]等。利用溶剂提取法提取多糖，操作简便、无需特殊仪器设备，但往往存在耗时、多糖得率低等缺点。在溶剂提取基础上发展起来的内部沸腾法[21-22]是指将一定体积分数的低沸点溶剂预先浸泡原料并进入组织内部，然后加入一定温度的高沸点溶剂使原料组织内部的低沸点溶剂迅速沸腾，破坏原料组织的网络结构，加速有效成分的溶解与扩散而实现对有效成分的提取。本文通过响应面法设计试验，以乙醇和水作为溶剂采用内部沸腾法提取桂花树叶中的多糖成分，为桂花树叶的开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

桂花树叶：采摘于内江师范学院校园内的挂花树；去离子水、无水葡萄糖、苯酚、0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液、0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）（pH<7.4）、0.75 mmol/L 的 FeSO4溶液、0.01% H2O2、无水乙醇：成都金山化学试剂有限公司；保鲜膜：市购。

电子分析天平（JA2003A）：上海精天电子仪器有限公司；100g手提式高速粉碎机（DFT-100）：温岭市林大机械有限公司；T6型新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；低速大容器离心机（DTL-5-A）：上海市嘉定区安亭工业园区园大路400号；优质超纯水机（UPT-Ⅱ-10T）：成都超纯科技有限公司；集热式磁力搅拌器（DF-10S）：常州未来仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 桂花树叶的预处理

将采摘的新鲜桂花树叶清洗干净，60℃下干燥至恒重，将桂花树叶放入高速粉碎机中粉碎3 min，制得桂花树叶干粉，用塑料密封袋装好，放入装有干燥剂的干燥器中备用。

1.2.2 桂花树叶多糖的提取及测定

称取2.000 g桂花树叶粉末放于100 mL的洁净干燥的锥形瓶，加入一定体积分数的乙醇溶液15 mL，浸泡30 min，使乙醇溶液能够充分进入桂花树叶粉末的内部，接着将一定温度、一定体积的热水加入到其中，使乙醇在植物组织内部产生沸腾，提取一定的时间，冷却后转移至离心机的塑料瓶中4 500 r/min离心5 min，将离心后的上清液转入至比色管中，去离子水定容到一定的体积得待测液。

精密称取无水葡萄糖7.4 mg，放于体积为50 mL的容量瓶，加入去离子水溶解并稀释至刻度线，得到葡萄糖的标准溶液为0.148 g/L。称取2.5 g苯酚溶于去离子水中，并用50 mL的容量瓶配制得5%的苯酚溶液。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，精密移取0、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于5支比色管中，去离子水稀释到2.0 mL，再加1 mL的5%的苯酚溶液，然后快速加入浓硫酸5 mL，摇晃均匀，静置20 min使其冷却到室温（25℃），空白溶液用去离子水，在波长为490 nm处测定吸光度，葡萄糖质量浓度（mg/mL）作横坐标，吸光度（A）作纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，并求出标准曲线回归方程得A=1.007C-0.110 9，R2=0.991 5。

待测液稀释到合适体积，取1 mL按上述方式显色定容后测定其吸光度，按标准曲线计算多糖含量。桂花树叶多糖得率（%）按式（1）计算。

式中：X为桂花树叶多糖得率，%；N为体积，mL；V为稀释倍数；m为称取的桂花树叶粉末的质量，g。

1.2.3 试验设计

单因素试验，以乙醇体积分数40%、液料比30∶1（mL/g）、提取温度80℃、提取时间7 min为基础，固定其中3个参数，改变其中1个参数以研究其对多糖得率的影响。乙醇体积分数主要考察20%、30%、40%、50%、60%5个水平，液料比主要考察10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50 ∶1（mL/g）5 个水平，提取温度主要考察 50、60、70、80、90 ℃ 5 个水平，提取时间主要考察5、6、7、8、9 min 5 个水平。

响应面试验，在单因素试验及参考相关文献的基础上，采用Box-Behnken安排试验。选取的因素及水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素及水平Table 1 Factors and levels in Box-Behnke design

1.3 抗氧化活性

以对·OH清除能力进行评价。样品管，取1.00 mL 0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液于比色管中，依次加入2.00 mL的0.20 mol/L磷酸盐缓冲溶液，1.00 mL去离子水和1.00 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，摇匀混合后，继续加入一定量样品溶液和1.00 mL 0.01% H2O2；不加样品的比色管，除不加样品外其余试液与样品管相同；对照管，除不加样品和H2O2外其余试液与样品管相同。将3支比色管摇匀后用去离子水定容至10 mL，然后放入恒温水浴箱，37℃下保温60 min，在波长为536 nm处分别测定吸光值（用A样品表示）。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

乙醇体积分数对多糖得率的影响见图1。

图1 乙醇体积分数对多糖得率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction

乙醇体积分数主要决定是否产生内部沸腾及沸腾的剧烈程度，以及提取溶剂的最终极性，当内部沸腾剧烈且提取溶剂的最终极性与提取目标物极性接近时提取效果最佳。由图1可以看出，乙醇体积分数太低，不易产生内部沸腾，对提取不利。同时桂花树叶多糖的极性比乙醇大，但比水小。起初桂花树叶多糖得率随着乙醇体积分数的逐步提高而逐步上升，桂花树叶多糖得率在乙醇体积分数40%时达到最大值。当乙醇体积分数继续增大，虽然内部沸腾更为剧烈，但桂花树叶多糖得率反而减小，说明由于极性的原因桂花树叶多糖在高浓度的乙醇溶液中溶解度降低。因此，初步确定最佳乙醇体积分数在40%左右。

液料比对多糖得率的影响见图2。

液料比与桂花树叶多糖得率存在一定的相关性。多糖提取时，多糖是从植物细胞的内部扩散至细胞的外部，扩散的推动力为细胞内外多糖浓度差，当多糖的浓度在细胞的内部和外部达到相等时，此时多糖的扩散处于一个平衡状态。当液料比逐渐增大，扩散达到平衡时细胞内部和外部的多糖浓度就会下降，从而导致更少的多糖残留在细胞内部，因此桂花树叶多糖得率就越大。液料比在30∶1（mL/g）的时多糖得率取得最大值，之后液料比继续增大多糖得率略有下降，可能是加入过多的水导致其它杂质的溶出而影响了多糖的提取。因此，初步确定最佳的液料比在30∶1（mL/g）左右。

图2 液料比对多糖得率的影响Fig.2 Effect of Effect of liquid-to-solid ratio on extraction

温度对多糖得率的影响见图3。

图3 提取温度对多糖得率的影响Fig.3 Effect of temperature on extraction

当提取温度慢慢升高，其多糖得率也逐渐升高，当温度达到80℃左右时多糖得率达到最大值，随后略呈降低趋势。温度主要影响分子的运动速率及化合物的稳定性，高温分子运动快，有利于提取。另外，当温度在乙醇溶液的共沸点温度之上时，进入到原料中的乙醇溶液会迅速沸腾起来，对流扩散为主导作用加速提取。如果温度太低，沸腾作用不强烈甚至无法沸腾，导致在较短的时间提取不完全。然而高温又可能导致多糖被破坏或其它杂质的溶出，多糖实际得率反而受到一定的影响。另外，温度过高导致溶剂挥发损失，能耗增加。因此，综合各方面因素，初步确定最佳提取温度为80℃左右。

提取时间对多糖得率的影响见图4。

起初桂花树叶多糖得率会随着提取时间的增加而上升。处于植物细胞内部的多糖扩散至细胞外部，这个过程需要一定时间。当提取时间非常短暂时，多糖的扩散没有达到平衡，以致于多糖提取不完全，提取的效果差。当提取时间到达7 min时，此时已经达到扩散平衡，可以观察到桂花树叶多糖得率达到最大值。扩散达到平衡后，继续延长提取时间多糖得率不会有明显的变化。另外，提取时间过长既耽误时间，又增加能耗。因此初步确定最佳提取时间为7 min左右。

图4 提取时间对多糖得率的影响Fig.4 Effect of time on extraction

2.2 响应面试验

2.2.1 试验安排及结果分析

响应面试验安排及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验及结果Table 2 Box-Behnken test and results

续表2 Box-Behnken试验及结果Continue table 2 Box-Behnken test and results

用Design Expert 8.0.5软件将表2中试验数据进行多元线性回归分析，得到桂花树叶多糖得率对A乙醇体积分数、B液料比、C提取温度、D提取时间的二次多项式回归模型：

对所建立的响应模型进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型系数显著性检验及方差分析Table 3 Regression model coefficients significant significance test and analysis of variance

由表3可知，试验选用的模型高度显著（P<0.000 1），失拟项不显著（P>0.01）；相关系数R＝0.99，说明该模型拟合效果好，试验误差小，可以用于分析内部沸腾法对桂花树叶多糖的提取。

从回归模型系数显著性检验结果可以看出，模型一次项A、B、C、D显著，说明选择这几个因素进行优化是较为合适的；模型二次项AB、BD、CD显著，说明各因素之间存在较为显著的交互作用；模型二次项B2显著，其它各项不显著。

2.2.2 响应面分析

响应面图形是响应值（即桂花树叶多糖得率）对各因素所构成的三维空间曲面图，图5～图10为A乙醇体积分数、B液料比、C提取温度、D提取时间在其中两个固定时，另外两个对桂花树叶多糖得率的交互影响曲面图。

图5 乙醇体积分数、液料比及交互作用Fig.5 Ethanol volume fraction，liquid to material ratio and interaction of them

图6 乙醇体积分数、提取温度及交互作用Fig.6 Ethanol volume fraction，extraction temperature and interaction of them

图7 乙醇体积分数、提取时间及交互作用Fig.7 Ethanol volume fraction，extraction time and interaction of them

图8 液料比、提取温度及交互作用Fig.8 Liquid to material ratio，extraction temperature and interaction of them

图9 液料比、提取时间及交互作用Fig.9 Liquid to material ratio，extraction time and interaction and interaction of them

图10 提取温度、提取时间及交互作用Fig.10 Extraction temperature，extraction time and interaction and interaction of them

由图5～图10可知，乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间对桂花树叶多糖得率的影响显著，表现为曲线较陡。响应面中的等高线的形状可以反映出两因素的交互作用的大小，等高线越接近于圆形且多条等高线越接近于共圆心，则这两个因素间的交互作用越弱；相反，等高线远离圆形趋势越大且多条等高线共圆心的趋势越小，则这两个因素间的交互作用越强。观察图5～图10中的等高线，容易发现AB、BD、CD交互作用显著，等高线形状远离圆形，且多条等高线不可能共圆心的趋势明显；AC、AD、BC交互作用弱，表现出多条等高线共圆心的趋势明显，结果与方差分析一致。

2.3 最优工艺条件的确定与验证

在限定范围内，由上述模型求最大值，当乙醇体积分数为33.39%、液料比为22.16∶1（mL/g）、提取温度为68.62℃、提取的时间为7.95 min时，桂花树叶多糖得率可达8.58%。为处理方便将提取条件略做修改，乙醇体积分数为 33%、液料比为 22∶1（mL/g）、提取温度为70℃、提取的时间为8 min，在此条件下3次平行试验桂花树叶多糖得率分别为8.62%、8.64%、8.61%，平均值为8.62%。结果表明响应面试验得到的提取工艺是可取的，桂花树叶多糖得率高，试验重复性好，具有一定的意义，最佳提取条件基本得到验证。

2.4 桂花树叶多糖的抗氧化活性

将最优工艺条件下得到的提取液定容至50 mL，分别取1、2、3、4 mL于4支比色管中，按抗氧化活性测定方法进行处理后测定吸光度并计算，得到4支比色管中样品溶液对·OH清除率分别为18.22%、37.34%、51.54%、70.86%，结果表明桂花树叶多糖具有较好的抗氧化活性，并且样品溶液对·OH清除率与浓度具有一定的相关性。

3 结论

经过单因素试验及响应面试验获得了内部沸腾法提取桂花树叶中多糖的最适宜工艺，即乙醇体积分数为33%、液料比为22∶1（mL/g）、提取温度为70℃、提取的时间为8 min，此时桂花树叶多糖得率可达8.62%；·OH清除测试结果表明桂花树叶多糖具有良好的抗氧化活性。以乙醇溶液及水为提取的溶剂，在提取过程中没有加入任何有害物质，因此内部沸腾法提取桂花树叶多糖不仅成本低，而且安全性高。由于操作简单，提取工艺易于放大，本文所得桂花树叶多糖提取工艺对于开发利用桂花树叶具有一定的参考价值。