细菌生物被膜检测与清除方法研究进展

张君怡，王静怡，巴巨伟，崔雪岩，崔佳琪，郝建雄

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050000）

1978年，英国学者J.Willam Costerton首次提出生物被膜的概念。细菌生物被膜（biofilm，BF）是指细菌黏附于接触表面上，同时分泌多糖蛋白复合物、纤维蛋白、脂质蛋白等物质从而形成的细菌聚集膜[1]。细菌的表面结构通过黏附在附着物表面形成生物被膜，如菌毛等结构[2]。生物被膜对细菌菌体具有强烈的保护作用，使菌体成为具有结构和复杂代谢的高度组织群体。生物被膜的结构符合Marc habas等提出的成熟生物被膜模型，即分别为基质层、条件层、连接层和生物被膜层。不同位置的生物被膜的体积和代谢活性均有显著差异。近年的研究表明，世界广为传播的致病菌均易形成生物被膜，如李斯特菌、假单胞菌和沙门氏菌等[3-4]。在食品厂房的地板、天花板、加工设备、工业管道等表面均易形成食源性致病菌生物被膜，生物被膜的形成不仅会损害设备，污染食品，还会传播食源性疾病。例如牙周炎是由产酸性革兰氏阳性菌球菌引发，心内膜炎与草绿色链球菌生物被膜形成息息相关。显然有关生物被膜的检测和清除已成为当下的热门。因此本文结合当前国内外对生物被膜的相关研究，拟对生物被膜的形成过程和调控机制、检测和清除方法的研究展开综述，旨在阐明生物被膜形成和机制以及检测和清除的方法技术，其在食品工业和慢性感染的预防和治疗中起到重要作用。

1 细菌生物被膜的形成

目前，研究者公认的细菌形成细菌生物被膜的过程包括黏附（adherence）、生长（growth）、成熟（maturation）、分散（dispersal）4 个阶段的动态过程[5]。

1.1 细菌黏附期

细菌黏附是形成细菌生物被膜的首要步骤。胞外大分子物质与生物材料表面受体相互作用产生附着力，具有特异性。根据细菌黏附在材料表面的原理不同可分为可逆黏附和不可逆黏附。首先，浮游菌通过鞭毛作用减少与固体表面之间的排斥力，固定到载体表面，这个黏附是可逆的。由胞外多聚物或鞭毛介导，使细胞牢固附着到材料表面，这个黏附是不可逆的。Takhistov等观察到，在3 s～5 s极短的时间内，细菌处在最不稳定黏附期状态，可以通过冲洗、加热等物理方法清除细菌生物被膜[6]。

1.2 生物被膜生长期

在与表面黏附接触后，细菌形成单层菌膜，细菌生长繁殖的同时分泌大量胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS），不断形成微菌落。蛋白质、多糖、核酸和磷脂等物质组成了EPS，EPS的形成使细菌相互黏结并黏附于物体表面[7]。在细菌生物被膜形成阶段，除观察到EPS的合成增加外，还有细菌生物被膜不断加厚成熟，增强其对于不利环境的抗性[8]。感应环境信号触发调控网络与胞内信号分子都可以调节细菌生物被膜的形成[9]。由于细菌生物被膜处于形成初期，设备表面细菌的附着力不是十分稳定。

1.3 生物被膜成熟期

此阶段EPS包裹细菌，微菌落大量聚集形成了成熟的细菌生物被膜。在成熟的细菌生物被膜内，细菌通过脱落、再黏附、再形成新的被膜的方式进入新的阶段。在这个阶段，细菌生物被膜的结构由扁平不均一向高度结构化发展，这也是它具有抗逆特性的原因之一。由于养料、酶和代谢废物的不断运输，细菌生物被膜此时结构比生长期的结构稳定，对各种不利环境因素的抵抗力也达到最强。此时，加大清洗力度和提高杀菌剂的剂量难以清除细菌生物被膜。

1.4 细菌的分散

分散是细菌生物被膜形成的第四阶段。生物被膜细菌受到环境和养料的限制，会离开附着表面，重新黏附于适宜生长新细菌生物被膜的表面。在新的接触表面，细菌生物被膜各条件的改变都会促进细菌表达相关的分散基因[10]。Sauer等[11]发现可获得性碳源数量的增长对铜绿假单胞菌生物被膜中的野生株呈促进作用。而离开的细菌又会重新进行以上4个步骤，生物被膜形成的不断循环为其难以清除的主要原因。

2 细菌生物被膜的调控机制

研究发现细菌细胞可以调控小分子信号分子，当信号分子的浓度达到一定阈值时，会和相应的受体蛋白结合，从而实现信息的传递[12]。这种通过细胞密度的细胞信息交流现象称为细菌的群体感应（quorum sensing，QS），该现象与生物被膜形成有关。所以干扰群体感应系统将成为抑制细菌生物被膜的有效手段。群体感应抑制剂可破坏受体蛋白的结合，减少细菌中的浓度，抑制细菌生物被膜生长。

研究发现在腐败细菌中，蛋白酶、果胶酶等都会在群体感应系统的控制下得到分泌[13]，荧光假单胞菌中的蛋白酶受基于酰基高丝氨酸内酯的群体感应系统调节[14]。Aifei Zhao等研究表明荧光假单胞菌细胞上清液加热有3种群体感应的诱导物，这表明加热不能抑制细胞上清液中的感应活性[15]。

QS可通过自体诱导物（autoinducer，AI）信号分子的产生、分泌和响应，感知细菌密度的变化，从而调控基因的表达[16]。QS主要可分为以下3种类型：（1）主要存在于革兰氏阴性菌中，以高丝氨酸内酯（acyl-homoserine lactones，AHL）介导的群体感应系统[17]。大多数革兰氏阴性菌中含有通过共价键连接外层膜和多糖的胞壁质脂蛋白（Braun's lipoprotein）。大肠杆菌中，AHL被LuxR型蛋白当作折叠开关使其结构稳定，并在没有这种信号的情况下退化[18]。（2）存在于革兰氏阳性菌中，以寡肽（autoinducing peptide，AIP）介导的群体感应系统。如单增李斯特菌中的AIP介导的Agr群体感应系统对细菌生物被膜的形成正调控，系统中的编码前提肽AgrD被AgrB翻译和修饰，AgrD被加工成具有诱导功能的信号肽，从而参与系统调控[19]。（3）除此之外，革兰氏阴性和阳性细菌中也存在信号分子AI-2介导的细菌群体感应系统。Ng等[20]证实，AI-2信号分子的合成与LuxS基因相关，一旦LuxS基因失活，AI-2信号分子将不会产生。研究发现，尽管LuxS在不同种属李斯特菌中具有比较保守的序列，但具有较高生物膜形成能力的菌株LuxS基因在不同的碱基位点上也存在差异[21]。LuxS/AI-2系统可以影响葡萄球菌属中生物膜的形成：生物膜形成的调控子Rbf，间接抑制IcaR的转录，导致Ica表达水平增高、Pia产生和生物被膜形成[22]。

细菌生物被膜状态下的细菌基因表达与浮游菌不完全相同。Huang Y Y等构建了gltb和gltc缺失的突变体，与野生型相比，这两种突变体的生物膜形成明显减少[23]。除此之外，还有APHA是弧菌中的一种小的PADR家族DNA结合调节剂，与生物膜形成和细菌的群体感应有关[24]。所以，aphA无效突变体中生物被膜胞外聚合物的减少导致生物膜形成减少[23]。研究发现生物膜的形成与鞭毛的合成代谢调控的基因突变有关，DNase I可以减少附着并分散已建立的生物膜，但没有完全抑制生物膜的发展。Nguyen等还发现蛋白酶K可分散食品级不锈钢上缺乏多糖合成编码基因的一些细菌形成的生物膜[25]。Uyen T发现蛋白酶K比DNase I分散现有生物膜更有效，且公认安全的菠萝蛋白酶在清除生物被膜也远不如蛋白酶K有效[26]。除此之外，lmo 1386是编码推定的DNA转位酶基因，复制lmo 1386补充分离株，整合其衍生物与细菌的启动子，基因互补突变体恢复了生物膜表型[27]。lmo 1386可以降低最初的黏附能力，导致生物膜受损，这也加强了对生物膜形成的理解。

3 细菌生物被膜检测方法

因细菌生物被膜表面具有多种微生物群落和胞外物质的特点，因此通过定性检测和定量检测，进一步对细菌生物被膜进行统计、比较和分析。

3.1 细菌生物被膜定性研究方法

细菌生物被膜定性研究方法主要借助各种染色方法（如银染法）、光学和光谱学方法（如光学和电子显微镜技术等）进行细菌生物被膜检查和监测，研究者更倾向于通过显微检查技术观察选取细菌生物被膜与细菌群体的结构参数和构效关系。

3.1.1 银染法

银染法是利用AgNO3溶液和多糖蛋白复合物产生反应生成黑色物质的原理，通过银染可以观察不同阶段细菌生物被膜中多糖蛋白复合物的变化趋势，并且用这种方法可以评估细菌的黏附性[28]。银染法操作简单，在试验条件较简易的实验室就可以进行操作，且能够鉴定大量生物被膜的形成能力[29]。

3.1.2 细胞培养板法

细胞培养板法通过冰醋酸溶解结晶紫染色生物被膜，并根据颜色对细菌生物被膜进行检测[30]。此法简单方便，检测迅速，适合在较简易的试验条件下定性检测细菌生物被膜，可用细胞培养板法定性溶藻弧菌[31]。

3.1.3 刚果红琼脂培养法

刚果红琼脂培养法的原理是在生物被膜的形成过程中会产生大量的胞外聚合物，其中的胞外多糖与刚果红结合，可观察到干燥的红褐色结晶。试验中多用刚果红琼脂培养法来对细菌的潜在毒力进行判断。

3.1.4 扫描显微镜和透射电镜扫描

电镜为研究人员提供了生物被膜的空间结构，并且可检测胞外物质的分布情况[32]。电子显微镜的方法也可以对细菌和真菌BF进行定量测定[33]，也可以对生物被膜的表型特征进行评价[34]。汪洋[35]通过苏木精-伊红染色和扫描电镜，观察luxS缺失株和野生株的生物被膜成像对比，为探究链球菌中luxS和生物被膜形成和其毒力迈出了至关重要的一步[36]。光学透镜被电子透镜代替，分辨率小于纳米，可以高倍放大物质的细微结构。透射电镜虽然可以深入了解生物被膜的形态结构和胞外聚合物的特征，但是透射电镜也有损伤样品与试验成本过高的不足。

3.1.5 激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CSLM）

该方法可以依据死活细胞膜的通透性不同，用激光共聚焦显微镜直接观察菌体活性的变化，从而定量测定生物被膜。常用刀豆素A（concanamycin A，ConA）等荧光结合凝集素，进行荧光标记后联合CLSM观察结果[37]。

3.2 细菌生物被膜定量研究方法

3.2.1 平板分析法

平板分析法工作强度大、耗费时间长、误差较大，不适宜样本观察，其中细菌生物被膜从黏附表面的剥离程度是影响试验结果的关键因素。这种方法很少单独使用，一般结合其他方法对细菌生物被膜进行定量研究。

3.2.2 超声波平板法

在质量合格的产品进入加工环节后，汪记在产品的每个阶段也都制定着严谨的工艺及操作规程，各个环节严格按照要求组织生产。生产过程中，设立质检监督岗位，对生产各环节的操作进行抽查验证，同时在生产现场各个工序环节安装视频监控系统，实时监控厂区生产操作，实现关键环节监控全覆盖、无盲区。

许多试验结果均显示超声波平板法的效果比平板法更有效率，该方法可以控制处理时间和温度，更改超声波功率，除此之外，该方法很少受到人为因素的影响，这是其更受青睐的原因。但超声波平板法也有缺点，如对于形成时间较长的细菌生物被膜还不能做到完全剥离，与平板分析一样也存在着测定误差；而且剥离后也需要进行平板计数，不能达到快速检测的要求[38]。

3.2.3 微孔板法

微孔板法是定量检测BF的常用方法。在评估生物被膜方面，微孔板和显微镜结合也起到了突出的作用[39]。Chavant实验在培养基中放入磁珠，定量计算磁珠表面形成生物被膜和基质组成已众所周知[40]。

3.2.4 结晶紫染色法

结晶紫染色法[41]是目前研究生物被膜使用频率最高的检测方法。结晶紫在表面湿润生物被膜，静置一段时间后，通过水洗的方法对未结合的结晶紫进行去除，经烘干处理后，用溶解液对生物被膜上的染料进行溶解，酶标仪对溶解液的吸光度的数值来反映生物被膜的数值。结晶紫染色法难度低，准确度高，试管和96孔板是最常用的培养生物被膜的载体。

3.2.5 荧光法

该方法利用不同的荧光染料可以选择性地观察细菌生物被膜，利用Syto9及碘化丙锭发出的不同荧光可以区分细菌生物被膜中的活菌与死菌[42]。荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）是通过核酸探针杂交原理，并应用非放射性荧光物质，在细胞核中或在染色体上显示DNA序列位置的方法，然后在细菌细胞内，用特异性荧光标记的寡核苷酸探针结合互补核苷酸序列。荧光法可以快速检测被测物质，方法安全，且核酸的探针可长期保存。杂交特异性是肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）探针荧光原位杂交技术的显著特性，这使得在判断细菌存在的基础上也不会损害细菌的结构[43]。荧光法与CLSM联用，可检测和鉴定伤口中特别是慢性伤口中细菌的各种情况，与传统的微生物检验技术相比，有很明显的优势。

3.2.6 试卤灵试验

刃天青是一种蓝色化合物，被活细胞代谢成粉色的试卤灵（resorufin），与平板计数得到的结果之间有很好的相关性[42]。在生物被膜中加入新鲜培养基和刃天青，使测定生物被膜的数量更为准确。这种方法主要用于真菌、葡萄球菌和变形链球菌的药敏试验。

3.2.7 MTT/XTT试验

许多四唑盐类染料可以对细菌生物被膜中活细胞进行定量，并可以区别出活细胞和死细胞，广泛应用于悬浮细胞的定量化和细菌生物被膜的定量研究中。但它的缺点是种内和种间变异较大，所以只能用来检测细胞相对活力，不能测绝对值。文献显示优化的 2，3，5-氯化三苯基四氮唑 （triphenyl tetrazolium choloride，TTC）可以来量化BF中细菌的代谢活性[43]。除此之外2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-5-[（苯氨基）羰基]-氢氧化四唑[2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyc）2-H-tetrazolium-5-car-boxanilide，XTT]不稳定，所以要需要现配现用。

3.2.8 ATP生物发光法

由于ATP生物发光法检测迅速、灵敏度高的特点，因此其在食品工业中具有的使用已十分普遍。但此方法极易受环境的干扰[44]。目前，国内外对生物被膜的检测方法不断更新，最新检测方法及其特点见表1。

表1 细菌生物被膜检测的最新研究进展Table 1 The latest research progress of bacterial biofilm detection

最新生物被膜检测方法显示超声尾波干涉法、MgZnO双门TFT生物传感器、RT-PCR法、圆盘扩散法以及备受瞩目的电化学法对比传统的定性或定量检测方法，灵敏度更高，消耗量更低，更适用于快速检测，检测结果也更加严谨和科学，为后续清除生物被膜奠定了更加坚实的基础。生物被膜的检测在鉴定和预防控制生物被膜领域均具有十分重要的应用价值。

4 细菌生物被膜的清除方法

细菌生物被膜对杀菌剂的抗性受到表面材料的影响，如不锈钢比玻璃对微生物更有更强的附着性[50]。进一步研究细菌生物被膜对杀菌剂的抗性因素，有助于选择性的针对细菌生物被膜进行有效控制。目前，控制细菌生物被膜的形成与发展的途径主要有4种：（1）防止微生物与食品表面接触；（2）阻止细菌生物被膜中的微生物生长；（3）阻断细菌生物被膜细菌细胞间的信号传递；（4）瓦解已经形成的细菌生物被膜结构[51]。

4.1 物理方法

控制细菌生物被膜的常用物理方法有超声波、低电流等。当没有抗生素或生物毒素时，含氯化合物的培养基抗菌效果明显。刘丽婷等[52]研究发现，低频超声不能单独影响细菌的生物膜，结合抗生素处理，可破坏细菌生物膜结构，显著提高杀菌效果。Caubet等[53]研究发现，射频电流为10 MHz的条件下，庆大霉素对生物被膜的控制作用对比于控制组明显增加。

4.2 化学方法

金属可以影响生物被膜的形成，高浓度的铁对生物被膜有促进作用，同时铁元素也是生物被膜形成三维结构必要元素[54]。表面活性剂也可以清除细菌生物被膜。如鼠李糖脂是假单胞菌属合成的表面活性剂，它能加快铜绿假单胞菌的脱落速度，同时，还可以对已形成的生物被膜起到破坏作用[55]。除此之外，通过观察5 000倍的金黄色葡萄球菌细菌生物被膜的扫描电镜照片发现，经酸性氧化电解水处理后，细菌胞外物质被破坏，菌体发生破裂，生物被膜细菌数量急剧下降，清除效果十分显著。

抗生素的大量使用导致的耐药性以致于细菌生物被膜难以清除，联合使用抗菌药物有利于清除细菌生物被膜，解决药物感染等问题。控制细菌生物被膜方法就是吸收某些生物活性成分到食品接触表面，从而抑制细菌的黏附。万珍艳[56]通过红霉素联合环丙沙星雾化吸入试验，通过电镜观察发现联合用药组导管内表面细菌生物被膜明显减少。所以抗生素的衍生物和化学合成物均是清除细菌生物被膜的有效途径。

在细菌生物被膜的防治阶段，抑制细菌的黏附和定植，可以有效预防细菌生物被膜的形成。如在材料表面涂聚乙二醇或纳米银，都可以防止细菌生物被膜的形成[57]。也可以通过使用不同光谱和处理方法根除细菌生物被膜。研究者将以上方法进行结合，如卤化呋喃酮，消毒剂以及纳米和微乳液结合对沙门氏菌生物膜有抑制作用[58]。此外，物理处理也可以与化学消毒剂结合使用，如低强度超声波增强了氯己定对生物膜细菌的作用[59]。

此外，国际上也有许多新型的抗生物膜剂。Cedric[60]指出胱胺可以阻止铜绿假单胞菌生物被膜的形成并破坏生物被膜。丁烯内酯是一种从海洋链霉菌中提取的有效的抗大环素化合物，以大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌为目标，Qi[61]证明了丁烯内酯不仅可以抑制生物膜的形成，并且可以消除被测细菌的生物膜。氯硝柳胺是一种广泛的驱虫药，对金黄色葡萄球菌和根霉的生物被膜抑制率可达到30%～60%，特别是氯硝柳胺和阿奇霉素联合使用对铜绿假单胞菌QS系统有明显的抑制作用[62]。Marikani Kannan等[63]发现碘化银纳米颗粒对革兰氏阳性菌和阴性菌都具有广泛的抗菌谱，对生物膜有很强的化学治疗作用，所以碘化银纳米颗粒可以作为生物膜形成的控制剂。目前，国内外针对细菌生物被膜的清除方法日新月异，新方法的清除效果更加高效便捷，具体见表2。

随着生物被膜相关研究的不断更新，清除生物被膜的最新研究进展为以酶处理、激光技术、大气冷等离子体、噬菌体溶素和电化学法等技术为基础，以上5种清除方法与传统的清除方法相比在定性或定量的水平上均体现清除效果的改善。也体现出单独使用一种方法很难将生物被膜完全清除，多种清除方法并存在一定程度上提高了清除效率，并降低生物被膜产生抗药性的风险。

表2 细菌生物被膜清除方法的最新研究进展Table 2 The latest research progress of bacterial biofilm removal methods

5 总结

以生物被膜形式存在的致病菌不仅会造成食品工业设备的腐蚀，更会污染食品，缩短食品货架期。本文从细菌生物被膜的生成、调控方面做了大量的整理，结合最新的研究进展对细菌生物被膜的现状进行了分析。为实现细菌生物被膜的有效控制，消除由生物被膜造成的食品安全隐患提供了综合性的认识。结合了不同检测和清除方法的优缺点，为后续生物被膜的相关研究提供了理论依据。然而，如何更准确寻找一种完整分析生物被膜形成的新方法，并探究低毒、高活性的生物被膜抑制剂以及多种方法联用清除生物被膜还有待更深入的探究。