改良封闭活检术在兔VX2移植性骨肿瘤模型穿刺活检中的应用

白磊鹏，吕家兴，李哲宏，甘新天，杨朝昕，曹海营，金宇

承德医学院附属医院创伤骨科，河北承德 067000

恶性骨肿瘤占20岁及其以下青少年恶性肿瘤的6%，其中约2/3为骨肉瘤，其余大部分属于尤因肉瘤家族[1]。虽然影像学检查可以获得肿瘤的病变性质、大小、解剖位置、对周围骨骼或软组织的影响，以及邻近关节和神经血管结构受累等基本信息，但临床一般将组织活检作为确定诊断的首选[2]。 细针抽吸活检创伤小、确诊率高，是目前闭合组织活检的主要方法[3]，但存在肿瘤细胞沿穿刺通道扩散的问题[4]。因此，本课题组对封闭活检技术进行了改良。VX2肿瘤是起源于Shope病毒诱导的人乳头状瘤来源的鳞状细胞癌[5]。大量研究发现，兔VX2肿瘤细胞生长迅速，可以接种到肺、肝脏、肌肉或骨骼组织[6-7]。兔VX2骨肿瘤模型具有人类恶性骨肿瘤类似的生物学特性，可用于模拟人骨肿瘤的增殖和转移过程[8-9]。因而，本研究采用兔VX2移植性骨肿瘤模型进行实验，探讨了改良封闭活检技术的应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物 日本大耳白兔(简称家兔)30只，雌雄各半，3个月龄，体重2.0～2.5 kg，购自北京市昌扬西山养殖场[动物许可证号：SCXK(京)2016-0007]。于温度25 ℃、湿度50%的环境下喂养，维持12 h/12 h光/暗周期。食物和水的获取受到限制(2次/d)。本研究获得承德医学院附属医院动物伦理委员会审核批准(批准文号LL047)。

1.2 实验细胞及仪器 VX2肿瘤细胞株购自重庆蒙博生物科技有限公司。X光机(OEC9800，上海先威光电科技有限公司)；Olympus-BX53光学显微镜(Olympus-BX53，日本Olympus公司)；骨髓穿刺抽吸活检针[BM09/15，德迈特医学技术(北京)有限公司]。用于封闭活检的自主设计改良通道内置式骨肿瘤病理组织取出装置(中国专利号ZL201416055578.0)由钛合金材料制作(图1、2)。

1.3 制作VX2肿瘤组织块 将VX2肿瘤细胞注入兔左股外侧肌进行连续传代培养，使用彩色多普勒超声评估肿瘤大小。4周后，皮下可触及3 cm×3 cm大小的肿块时，经耳缘静脉注射麻醉(戊巴比妥钠35 mg/kg)，以兔角膜反射消失为麻醉成功的标志。去除肿瘤区兔毛，俯卧位固定于动物实验操作台上，碘伏消毒术区，铺盖无菌孔巾，切开皮肤，分离皮下组织、肿瘤。将肿瘤完整取出后移至无菌工作台上，置于37 ℃的PBS中清洗3遍，去除血迹、坏死组织和纤维组织，用眼科剪将肿瘤剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块。

图1 内置通道装置进行骨肿瘤封闭活检的原理Fig.1 Principle of closed biopsy of bone tumor with built-in channel device

图2 改良内置通道骨肿瘤活检装置Fig.2 Improved internal channel biopsy device for bone tumor biopsy

1.4 VX2骨肿瘤模型制备 30只家兔经耳缘静脉注射麻醉(戊巴比妥钠35 mg/kg)，后肢备皮，仰卧位固定于操作台上，碘伏消毒后铺无菌孔单。选取膝关节内侧皮肤做1 cm长切口，逐层切开皮下组织和筋膜，暴露髌韧带，纵行钝性分离髌韧带，显露胫骨平台，在胫骨平台面用克氏针(直径1 mm)钻孔，将1 cm长的套管插入骨孔后，用顶棒将体积为1 mm3的VX2肿瘤组织块沿套管推入胫骨髓腔内，拔出套管，骨蜡封堵骨孔，无水乙醇冲洗骨孔周围组织3次，每次保留无水乙醇浸泡1 min以上，重建髌韧带后，逐层缝合切口。双侧胫骨均以上述方法植瘤，待家兔麻醉苏醒后，放回笼舍继续喂养。所有家兔左腿设为实验组，采用改良封闭活检技术进行活检，右腿设为对照组，采用空芯穿刺针进行活检。两组家兔术后均大腿肌注青霉素80万U/次， 1次/d，连续3 d，造模完成。

1.5 骨组织活检 造模后7 d，经耳缘静脉注射麻醉(戊巴比妥钠35 mg/kg)家兔，在X线引导下，以左侧膝关节下1 cm处胫骨外侧为穿刺点，做0.5 cm纵行切口。将内置通道安装在穿刺手柄上，穿透骨皮质，进入髓腔内，拔出穿刺手柄，内置通道留在骨皮质内形成人工通道，以G14号注射器针头通过内置通道抽取2 ml髓腔内容物后，将尾钉拧入内置通道内(图3)，达到封闭穿刺通道的效果，然后逐层缝合切口。右侧胫骨模拟临床中对骨肿瘤进行空芯穿刺针抽吸活检诊断的方法，以相同方法在右侧膝关节下1 cm处胫骨外侧作为穿刺点，暴露骨面后以骨髓穿刺针进行穿刺活检，获取2 ml骨髓标本后，穿刺孔不做封堵处理，压迫止血，逐层缝合切口。骨肿瘤穿刺完成，待家兔麻醉苏醒后，放回笼舍继续喂养。两组家兔术后均大腿肌注青霉素 80万U/次，1次/d，连续3 d。

图3 通道内置肿瘤活检装置进行家兔活检的过程Fig.3 The process of performing a tumor biopsy of rabbit using a internal channel

1.6 穿刺孔周围软组织影像学、病理学检测 造模后14 d，行X线检查双侧胫骨后，经腹腔注射麻醉(戊巴比妥钠，40 mg/kg)，耳缘静脉空气栓塞处死家兔，以胸部可触及心跳消失为死亡标志。手术切除穿刺孔外周2 cm范围内的软组织，由病理科医师对其进行HE染色并镜检。镜检结果由同一高年资病理医师以盲法进行。

1.7 统计学处理 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。采用χ2检验分析造模后14 d的影像学检查结果和病理检测结果。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 造模和骨组织活检结果30只家兔造模后，1只骨髓穿刺后1 d休克死亡，2只在造模后9 d因多脏器衰竭死亡，最终共27只纳入研究。造模植瘤切口与穿刺活检切口处均无明显感染，但皮肤组织生长愈合缓慢。27只家兔活检骨组织病理检测均检出肿瘤细胞，肿瘤确诊率均为100.00%。

2.2 穿刺孔周围软组织影像学、病理学检测结果造模14 d时，X线检查结果显示，所有内置通道在穿刺孔位置良好(图4)，实验组4只、对照组11只家兔胫骨穿刺孔周围出现骨膜反应和骨外高密度影。两组穿刺孔周围骨膜反应和骨外高密度影出现率比较[14.81%(4/27) vs. 40.74%(11/27)]差异有统计学意义(χ2=35.092，P<0.05)。穿刺孔周围软组织病理检测结果显示，实验组8只、对照组27只家兔穿刺孔周围软组织镜下检出肿瘤细胞(图5)，两组肿瘤细胞转移率比较[29.63%(8/27) vs. 100.00%(27/27)]差异有统计学意义(χ2=29.314，P<0.05)。

图4 家兔造模第14天穿刺通道周围胫骨X线片Fig.4 X-ray of tibia around puncture passage on the 14th day of rabbit modeling

图5 家兔活检获得组织及造模第14天穿刺孔周围软组织病理检查结果(HE ×40)Fig.5 The tissue obtained by rabbit biopsy and the pathology of soft tissue around the puncture hole on the 14th day of modeling (HE ×40)

3 讨 论

近年来，恶性肿瘤的治疗已成为世界范围的医学问题[10]，骨肿瘤的发病率也在逐年增高[1]。适当、及时的诊断检查和多学科协作的治疗方法对于提高肿瘤的治疗效果十分重要。肿瘤的最终诊断需要结合临床表现、影像学、病理学和分子生物学检测结果[11-12]。准确的病理诊断有助于选择合适的治疗计划，有利于改善预后。目前组织活检仍是临床诊断肿瘤的“金标准”[13]，但需要经验丰富的团队正确设计和实施。活检后遗留的穿刺通道出血、肿瘤细胞扩散等逐渐引起临床医师的关注，对穿刺通道进行切除或封堵逐渐成为共识[14-15]。

组织活检的方法有闭合活检、切口活检和切除活检[16]。其中切口活检的优点为可获得充足的肿瘤样本和较高的诊断准确率[17]，缺点为出血和局部肿瘤细胞扩散。此外，切口可能会影响随后的手术治疗。闭合活检包括细针抽吸活检和空芯针活检，优点为创伤小、出血少、操作简便，是骨科医师最常用的方法；缺点为获取的肿瘤样本较少[18]。活检完成后，穿刺孔需要压迫止血或用骨蜡封堵，在机体组织的自然愈合下，穿刺孔会自然闭合[19]。但在此之前，肿瘤细胞在髓腔内外压力差的作用下，可能会扩散到肿瘤穿刺孔外。现有的组织活检技术会破坏肿瘤周围的自然屏障，导致渗出或肿瘤细胞扩 散[20-23]。Barrientos等[15]发现，穿刺针活检患者中穿刺通道肿瘤种植发生率为0.8%。

本研究中用于减少肿瘤细胞沿穿刺通道扩散的内置通道活检仪器是本课题组的专利产品(中国专利号ZL201416055578.0)。内置通道和封堵螺钉使用可置入人体的钛合金材料制作，可长期留置于体内。通过置入金属通道，抽吸获得足够的病理组织，然后拧入封堵螺钉达到闭合穿刺通道的目的，从而减少局部渗出和肿瘤细胞扩散。本研究使用的兔VX2移植性骨肿瘤模型是常用的骨肿瘤动物模型[24-26]。以往研究显示，VX2肿瘤细胞移植后第1周，胫骨肿瘤在髓腔内生长缓慢，骨皮质完整；第2周，肿瘤基本上可生长至骨皮质边缘；第3周X线片显示肿瘤生长迅速，骨皮质部分破坏，但不会出现在周围软组织中[27]。为了消除肿瘤对周围软组织的影响，使实验过程更加符合临床诊断过程，本研究采用了1周模型，实验组穿刺孔周围骨膜反应和骨外高密度影出现率、肿瘤细胞转移率均低于对照组，表明改进后的活检方法能有效防止肿瘤扩散。

本研究具有一定的局限性：相对家兔的体型，实验中所使用器械较大，导致两种穿刺方法均可100%检出肿瘤细胞。空芯针活检穿刺通道较大，导致对照组穿刺孔外周软组织肿瘤浸润率过高，并且由于样本量小，导致数据发生偏倚。而封闭活检装置由于金属穿刺通道的限制，穿刺中取材方向有限，在应用中可能出现假阴性结果，且此装置对于留置部位的适用性，对骨骼强度的影响，以及长期留置体内是否会导致排异反应等有待深入研究，本课题组将继续改进该装置设计，并进行进一步的研究，以期为临床诊断提供更多参考。

综上所述，改良封闭活检技术不仅物理隔离了肿瘤与穿刺通道的骨组织、外周软组织，且封堵了穿刺孔。整套装置是由可以置入人体的钛合金制成的，可以稳定地固定在穿刺孔，以防止肿瘤扩散。本研究结果表明，采用内置通道活检技术在兔VX2移植性骨肿瘤模型中进行穿刺活检，可以减少胫骨穿刺孔的肿瘤细胞扩散。