整合素α5对宫颈癌转移及预后的作用*

杨晓新， 王泽华， 蔡 娥△

1武汉大学附属同仁医院(武汉市第三医院)妇产科，武汉 430060 2华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，武汉 430022

宫颈癌是全球女性第4常见的恶性肿瘤，2018年新发病例约57万例，死亡人数高达31.1万例，并且80%发生在发展中国家[1]。尽管宫颈癌筛查及HPV疫苗的普及一定程度上降低了宫颈癌的发病率，但仍有一部分患者发现时已处于宫颈癌的中晚期，治疗效果及预后较差。宫颈癌局部浸润是导致患者临床分期靠后的主要原因，因此探究宫颈癌浸润转移的机制十分必要。

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞失去细胞极性和细胞间粘附能力，获得迁移及侵袭等间质细胞特性的过程，该过程伴随着上皮细胞表型如E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达下降以及间质细胞表型如波形蛋白(Vimentin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)等分子的表达上升。已有证据表明宫颈癌细胞发生EMT与浸润转移密切相关[2]，然而调控宫颈癌浸润转移及EMT的关键分子仍待进一步研究。整合素是一类异二聚体跨膜粘附分子，由18种α亚基和8种β亚基可以组合出24种亚型，在人体内表达于多种细胞表面，可以介导细胞与细胞、细胞与基质的相互作用[3-4]。近年来研究发现整合素α5参与调控肿瘤的发生发展过程。例如，在乳腺癌、结直肠癌及卵巢癌等肿瘤细胞中，整合素α5均高表达，并且与患者的不良预后相关，体外实验进一步证实其能够调节肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及耐药等多种恶性生物学行为[5-7]。Wang等[8]的研究显示宫颈癌组织中整合素α5β1表达水平明显高于正常宫颈组织，然而整合素α5的具体作用尚不清楚。因此，本研究旨在进一步探究整合素α5对宫颈癌的预后意义以及对宫颈癌细胞SiHa迁移、侵袭及EMT的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人宫颈癌细胞系SiHa购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。RPMI-1640培养液、四季青胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素链霉素溶液及LB培养液均购自上海源培有限公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；人整合素α5质粒、NC质粒及菌液均购自上海吉玛有限公司。高纯度质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司。Transwell小室和基质胶购自美国Corning公司；整合素α5、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、GAPDH一抗均购自英国Abcam公司，二抗及DAPI均购自美国KPL公司。Trizol、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司。NP40裂解液、Cocktail、ECL超敏检测试剂、SDS-PAGE配制试剂盒、蛋白上样缓冲液、电泳液及转膜液均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分析整合素α5对宫颈癌患者预后的影响 利用在线工具Kaplan-Meier Plotter(KM-plotter，https：//kmplot.com/analysis/[9])分析整合素α5 mRNA表达水平与宫颈癌患者总生存期(overall survival，OS)的相关性。筛选的条件设定为：①mRNA RNA-seq：Start KM plotter for pan-cancer；②Gene symbol：ITGA5，RNA-Seq ID；③Split patients by：Auto select best cutoff；④Survival：OS；⑤Follow up threshold：all；⑥Select all：Cervical squamous cell carcinoma(n=304)；其余选择默认设置。

1.2.2 细胞培养 将SiHa细胞接种于RPMI-1640培养液中(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和链霉素)，放置37℃和5%CO2培养箱中培养，待细胞融合度达80%左右即可传代处理。

1.2.3 质粒提取 取10 μL菌液加入含20 mL LB培养液的无菌离心管中，加入20 μL 100 mg/mL氨苄青霉素溶液(所购整合素α5和NC质粒均含氨苄青霉素抗性基因)，37℃，220 r/min振荡培养12～16 h。按质粒提取试剂盒说明书进行操作。利用NanoDrop 2000测量质粒溶液浓度，直接进行转染操作或-20℃保存。

1.2.4 细胞转染 SiHa细胞转染分为2组：plasmid NC组，plasmid α5组，分别转染对照质粒和过表达整合素α5质粒。取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化成单个细胞，进行细胞计数，取2×105个细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁并生长至70%左右密度进行转染，具体转染操作参照Lipofectamine 2000说明书。转染48 h后收集细胞用于检测转染效率及进行后续实验。

1.2.5 Transwell迁移侵袭实验 侵袭实验：在冰上按无血清RPMI培养液∶基质胶=30∶1的比例配制所需基质胶，吸取100 μL轻柔加入Transwell小室上层，37℃培养箱孵育1 h后取出小室，吸弃上室多余液体，加入2×105的SiHa细胞悬液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI培养液。细胞37℃培养箱孵育36 h。取出小室，棉签擦去上室表面细胞，4%多聚甲醛室温固定30 min，0.1%结晶紫溶液染色2 h，PBS冲洗3次，显微镜下拍照并计数。迁移实验：不需要加入基质胶稀释液，其余步骤同侵袭实验。

1.2.6 Western blot实验 收集转染后的细胞，加入含1% Cocktail的NP40裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取20 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，4℃转膜1.5 h，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。分别加入稀释后的整合素α5(1∶2000)、E-cadherin(1∶1000)、N-cadherin(1∶200)、Vimentin(1∶400)、GAPDH(1∶5000)一抗，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，加入二抗(1∶5000)，室温孵育1.5 h，TBST漂洗3次，采用ECL法发光显影。

1.2.7 qRT-PCR检测 收集转染后的细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，NanoDrop 2000测定RNA浓度，按照逆转录试剂盒操作合成cDNA。Amplification机器进行DNA扩增，条件如下：酶活化95℃ 30 s，变性95℃ 5 s，退火及延伸60℃ 30 s。反应完成后得到各孔Ct值，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA表达水平。

1.2.8 免疫荧光检测 将转染后的细胞用胰酶消化成单个细胞，细胞计数仪计数，取1.5×104的细胞接种于24孔板，于培养箱继续培养。待细胞贴壁后吸去培养液，每孔加入4%多聚甲醛300 μL，室温固定30 min，PBS漂洗2次，加入0.5%Triton X-100破膜液300 μL，室温静置10 min，吸弃破膜液，加入0.5%BSA封闭液300 μL处理1 h。吸弃封闭液，分别加入一抗E-cadherin(1∶200)，Vimentin(1∶400)，N-cadherin(1∶200)，4℃孵育过夜。次日弃一抗，加入PBS放置摇床上漂洗3次，每次5 min。然后E-cadherin组加入绿色荧光二抗(1∶200)，Vimentin、N-cadherin组加入红色荧光二抗(1∶200)，室温孵育1 h，随后PBS摇床上避光漂洗3次，每次5 min。随后每孔加入核染色剂DAPI(1∶5000)，孵育5 min，PBS漂洗3次。随后荧光倒置显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 整合素α5表达与宫颈癌患者预后的关系

KM-plotter生存分析结果发现，宫颈癌中整合素α5 mRNA表达水平与患者总生存期(OS)呈负相关，即整合素α5表达越高，患者总生存时间越短(HR=2.86，95%CI=1.79～4.57，P<0.01)。见图1。

图1 宫颈癌中整合素α5表达与患者预后的相关性Fig.1 Correlation between the expression of integrin α5 and prognosis of patients with cervical cancer

2.2 整合素α5质粒成功上调SiHa细胞中α5表达水平

为了检测整合素α5过表达质粒的调控效率，我们采用qRT-PCR和Western blot检测发现，相较于NC质粒组，转染了α5过表达质粒的SiHa细胞其整合素α5在mRNA水平上调了17330.3倍，P<0.05，差异具有统计学意义(图2A)。Western blot显示转染α5质粒组较NC组整合素α5蛋白表达明显增多(图2B)。

图2 qRT-PCR(A)和Western blot(B)验证SiHa细胞中整合素α5上调Fig.2 Detection of the upregulation of integrin α5 expression in SiHa cells by qRT-PCR(A)and Western blot(B)

2.3 上调整合素α5增强宫颈癌SiHa细胞迁移和侵袭能力

为了确定整合素α5对宫颈癌SiHa细胞迁移和侵袭的影响，我们采用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力变化。迁移实验结果显示，转染NC质粒的对照组中，穿膜细胞个数为(36.0±5.0)，α5质粒上调组穿膜细胞个数为(69.3±5.7)，差异有统计学意义(P<0.05)；侵袭实验结果显示，NC组穿膜细胞个数为(22.3±2.1)，α5质粒上调组穿膜细胞个数为(38.7±2.1)，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明上调SiHa细胞中整合素α5可以增强细胞迁移和侵袭能力(图3)。

2.4 上调整合素α5促进宫颈癌细胞SiHa发生EMT

为了进一步探究整合素α5对宫颈癌细胞SiHa上皮间质转化过程的影响，我们采用Western blot和免疫荧光技术检测整合素α5上调组及NC组中EMT相关分子E-cadherin、Vimentin、N-cadherin的表达变化。结果显示(图4)：在SiHa细胞中上调整合素α5后，E-cadherin表达下降，荧光强度减弱，而Vimentin、N-cadherin表达增加，荧光强度增强，说明整合素α5促进SiHa细胞发生上皮间质转化。

图3 整合素α5对宫颈癌细胞SiHa迁移和侵袭能力的影响Fig.3 Effect of integrin α5 on migration and invasion of cervical cancer cells SiHa

A：Western blot检测E-cadherin、Vimentin及N-cadherin蛋白表达水平变化；B：免疫荧光检测E-cadherin、Vimentin及N-cadherin蛋白表达水平变化，标尺=50μm。图4 整合素α5对EMT相关分子的影响Fig.4 Effect of integrin α5 on EMT-related proteins

3 讨论

宫颈癌是我国最常见的妇科恶性肿瘤，发生转移的晚期患者5年生存率明显下降。肿瘤细胞迁移、侵袭能力增强是导致肿瘤转移的关键[10]，本研究利用在线数据库KM-plotter进行预后分析，结果显示宫颈癌患者整合素α5高表达与不良预后相关，并且首次探究了整合素α5对宫颈癌细胞SiHa迁移侵袭的作用，发现整合素α5可以促进SiHa细胞的迁移侵袭能力及上皮间质转化(EMT)。

整合素α5作为细胞粘附分子中的一员，在多种肿瘤中发挥促癌基因的功能。在乳腺癌中，整合素α5通过ITGA5/Src/Vav2/Rac1通路促进肿瘤细胞生长及转移[5]；在结肠癌中，下调整合素α5可减缓肿瘤生长，促进肿瘤凋亡[6]。在本研究中，我们首先通过数据库大样本分析304例宫颈癌患者组织中整合素α5表达水平与预后的相关性，发现整合素α5高表达的患者总生存时间明显短于低表达患者，这与之前Wang等[8]研究报道相一致。随后，通过体外质粒转染上调宫颈癌细胞SiHa中整合素α5的表达，并采用Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力，发现SiHa细胞整合素α5表达增加后，细胞迁移、侵袭明显增强。这一结果提示整合素α5在宫颈癌的进展尤其是转移过程中发挥重要促进作用。

EMT被认为是肿瘤转移的起始步骤，它使肿瘤细胞运动及侵袭能力增强，从而促进肿瘤脱离原发病灶，向远处播散[11]。有研究提示在乳腺癌中，整合素α5可以通过使Rac1b定位于细胞膜从而促进肿瘤细胞发生EMT[12]。通过Western blot及细胞免疫荧光技术，我们发现在SiHa细胞中上调整合素α5表达可以使E-cadherin表达下降，Vimentin、N-cadherin表达上升，提示整合素α5促进SiHa细胞的EMT过程。这与上述整合素α5促进SiHa细胞迁移、侵袭能力的结果相符合。提示整合素α5可能通过影响肿瘤细胞EMT过程从而影响细胞迁移、侵袭能力，具体机制仍待进一步研究。

综上所述，本研究首次通过生物信息学方法分析了临床大样本数据库资料，发现了整合素α5在宫颈癌中的预后意义，提示其作为宫颈癌预后生物标记物的潜在意义。并且在体外水平揭示了整合素α5对宫颈癌细胞SiHa迁移、侵袭能力及EMT的促进作用，为研究整合素α5在宫颈癌转移中作用提供了一定的理论基础，也为晚期宫颈癌的治疗提供了新思路。