低剂量环磷酰胺联合胸腺肽疗法对尖锐湿疣角质形成细胞增殖及凋亡的影响*

谌素素， 曹育春， 张 勇△

1华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科，武汉 430030 2武汉友芝友生物制药有限公司，武汉 430075

尖锐湿疣(condyloma acuminatum，CA)是一种由人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染引起的性传播性疾病，临床表现以疣状病变为主。CA常发生于外生殖器及肛周，绝大多数通过性传播方式感染，临床上表现为赘生物[1-2]。目前公认CA高复发与全身及局部免疫抑制状态有直接关系，但具体的免疫抑制机制不是十分明确，对此国内外研究者一直在努力探索。我们课题组对此亦做了一些研究，发现Foxp3+Treg介导了CA局部免疫抑制状态[3]。进一步研究发现Foxp3+Treg胞内的ATP水平低于其它T淋巴细胞亚群，细胞内谷胱甘肽介导的氧化还原系统分解毒性物质依赖ATP，因而对环磷酰胺代谢产物的毒性很敏感。环磷酰胺作为免疫抑制剂多用于结缔组织病及肿瘤化疗患者，但低剂量环磷酰胺有增强机体免疫功能的作用[4]。我们进一步研究发现低剂量环磷酰胺可选择性地消减Foxp3+Treg细胞，而其它T细胞亚群不受影响[5]。临床用低剂量环磷酰胺能改善CA局部细胞免疫功能，有效治疗并阻止CA复发[5-6]。由此建立了环磷酰胺治疗CA的“间歇、短程、低剂量”给药方法[即：环磷酰胺1 mg/(kg·d)，连续服药7 d停3 d为1疗程，共3～6疗程]，经临床治疗证实，该疗法可有效治疗CA并显著降低患者的复发率，同时费用低，毒副作用不明显[6-7]。胸腺肽具有提高机体细胞免疫功能的作用[8]，我们也曾用低剂量环磷酰胺联合胸腺肽治疗CA取得较好的临床疗效[9]。为充分改善患者免疫状态，拟定了“低剂量环磷酰胺联合胸腺肽治疗CA”疗法。

以上仅仅从免疫学角度奠定了该疗法的理论基础，但其具体作用的分子机制并不明确。CA的主要特征性病理改变为表皮呈乳头瘤样增生，增生的棘层上方可见不同数量的“挖空细胞”。前期经该疗法治疗1个月后的CA患者，显示较多病例的疣体缩小，甚至完全消退。为初步探讨该疗法的分子机制，结合其病理改变，本研究以该疗法治疗1个月后有效病例为研究对象，主要探讨治疗前后疣体组织在增殖与凋亡层面的变化。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2016年9月至2017年12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科门诊就诊的初次发病CA患者：年龄18～65岁；有典型皮损，皮损检测HPV6/11-DNA(+)；就诊前4周内未接受过局部或全身免疫调节剂治疗；无环磷酰胺药物使用禁忌。所有患者治疗前签署知情同意书。服用低剂量环磷酰胺联合胸腺肽治疗1个月后，收集到符合条件患者55人，其中男性30例，女性25例。疗效判定标准：①完全缓解：皮损完全消退；②大部分缓解：皮损数量消退50%以上或面积缩小50%以上；③小部分缓解：皮损数量消退50%以下或面积缩小50%以下；④无反应：皮损无变化或增大、增多。

1.2 治疗方法

复方环磷酰胺片(泰魁，通化茂祥制药有限公司)1 mg/(kg·d)，服药7 d停3 d为1个疗程，连续3个疗程；胸腺肽肠溶片(迪赛，西安迪赛生物药业有限责任公司)30 mg/次，2次/d，服药30 d。治疗结束后针对疣体消退程度采取对应后续治疗：①皮损完全消退患者继续该疗法1～3疗程；②皮损大部分缓解和小部分缓解患者予以激光去除疣体，同时继续该疗法1～3疗程；③无反应患者视为该疗法无效，予以停药，给予激光去疣或其他治疗。

1.3 标本采集及预处理

患者服药前及服药1个月后皮损取材，采用PCR测定HPV 6/11-DNA，检测过程在华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科实验室统一进行。手术切取患者治疗前后的疣体各1枚进行石蜡包埋，制作石蜡切片。

1.4 试剂与仪器

Cleaved Caspase-3抗体(兔，1∶100，三鹰生物技术有限公司)，Ki-67抗体(鼠，1∶200，三鹰生物技术有限公司)，HPV 6/11-DNA原位杂交试剂盒[泰普生物科学(中国)有限公司]。

1.5 检测方法

用随机数字表法选取符合疗效标准中的“大部分缓解”17例及“小部分缓解”3例共20例患者相应标本。①免疫组化ABC法检测Cleaved Caspase-3和Ki-67：石蜡切片脱蜡及水化，组织抗原修复，添加一抗(Cleaved Caspase-3，Ki-67)，滴加二抗(1%BSA)，DAB显色，苏木精复染，脱水及透明，树脂封片。②原位杂交检测HPV6/11-DNA：石蜡切片脱蜡及水化，杂交预处理，杂交，DAB显色脱水及透明，树脂封片。

1.6 阳性评判标准

随机选取5个400倍视野，按阳性细胞比例计分：未见阳性细胞者评定为0分，阳性细胞比例<25%者评定为1分，阳性细胞比例25%～75%者评定为2分，阳性细胞比例>75%者评定为3分；按显色深浅计分：不显色或显色模糊者评定为0分，浅黄色者评定为1分，棕黄色者评定为2分，棕褐色者评定为3分；以上述二者之和判定结果：0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中度阳性()，>5分为强阳性()。

1.7 统计学方法

20例患者皮损处PCR定量检测HPV6/11-DNA，结果统计后输入Graphpad Prism 6软件，经t检验分析治疗前后HPV拷贝数差异，以P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 低剂量环磷酰胺联合胸腺肽治疗CA有效病例的筛选结果

该疗法治疗1个月后，按时复诊的CA患者共计55人，其中皮损完全缓解14人，占比例为25.5%；大部分缓解30人，占比例为54.5%(大部分缓解的典型病例见图1)；小部分缓解6人，占比例为10.9%；无反应5人，占比例为9.1%。

2.2 治疗前后疣体KCs中的增殖指标Ki-67及凋亡指标Cleaved Caspase-3的表达情况

随机数字表法选出20例治疗有效的CA患者，免疫组化检测该疗法治疗前后CA患者局部增殖指标Ki-67及凋亡指标Cleaved Caspase-3。图2显示3例患者的检测结果，Ki-67阳性细胞多数为核着色，呈棕黄色，少数为胞质弱染色。Cleaved Caspase-3阳性表达于胞质。20例患者治疗前后疣体角质形成细胞(KCs)中Ki-67阳性表达情况：治疗前Ki-67阳性表达多为阳性()或强阳性()，治疗后表达多为阴性或弱阳性(+)(表1)，比较治疗前后阳性表达率，差异具有统计学意义(P<0.01)。20例患者治疗前后疣体KCs中Cleaved Caspase-3阳性表达情况：治疗前Cleaved Caspase-3的表达多在(-)～()，治疗后表达多为()～()(表2)，比较治疗前后阳性表达率，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图1 低剂量环磷酰胺联合胸腺肽治疗CA患者治疗前后皮损变化Fig.1 Images of lesion changes from two representative patients of CA before and after low-dose cyclophosphamide combined with thymosin treatment

图2 免疫组化检测治疗前后KCs中Ki-67及Cleaved Caspase-3的表达(×100)Fig.2 Ki-67 and Cleaved Caspase-3 expression by immunohistochemistry before and after treatment(×100)

表1 治疗前后疣体KCs中Ki-67的表达Table 1 Ki-67 expression in KCs of warts before and after treatment

表2 治疗前后疣体KCs中Cleaved Caspase-3的表达Table 2 Cleaved Caspase-3 expression in KCs of warts before and after treatment

2.3 治疗前后疣体内HPV阳性细胞表达的变化及疣体表面HPV载量的变化

用HPV6/11原位杂交方法显示该疗法治疗前后疣体内HPV的变化。结果显示：治疗前棘层细胞核及胞质、颗粒层细胞内均有明显的表达，而治疗后主要是棘层细胞的胞核表达。治疗后表达的阳性细胞数减少(典型病例的阳性细胞数变化见图3)；治疗后疣体表面HPV6/11-DNA的实时定量PCR病毒载量明显低于治疗前(P<0.01)，见图4。

图3 治疗前后疣体内HPV阳性细胞表达的变化Fig.3 The changes of HPV positive cell expression in warts before and after treatment

图4 治疗前后疣体内HPV病毒载量的变化Fig.4 The changes of HPV DNA copies in warts before and after treatment

3 讨论

《尖锐湿疣诊疗指南(2014)》及最新的《尖锐湿疣治疗专家共识(2017)》均明确指出：CA治疗的基本原则是尽早去除疣体，改善症状，尽可能消除疣体周围亚临床感染和潜伏感染，减少复发[10-11]。在CA的治疗过程中，如仅使用物理治疗，其6个月内的复发率超过67%。因此目前CA的主流治疗方案是物理治疗清除疣体，再结合药物治疗抑制其复发，其复发率可降至20%左右。但整个治疗过程繁琐，费用较高，患者需多次承受物理治疗的痛苦。探寻安全、有效治疗CA并阻止其复发的新方法，同时对其机制加以阐明，对该疾病的诊疗具有重要的临床价值。

本研究首先用低剂量环磷酰胺联合胸腺肽治疗CA患者55例，用自身前后对照的方法发现其中50例有临床疗效，除皮损完全消退的14例外，我们从剩余36例有效病例中按照随机数字表法选取20例患者的小样本，进一步探讨该疗法治疗CA的作用机制是否与影响疣体KCs的增殖和凋亡有关。

Ki-67蛋白是一组与细胞增殖有关的非组核蛋白，在细胞周期的G1期、S期、G2期、M期均有表达，但在静息细胞(G0)中不表达或低表达，因此，Ki-67蛋白与细胞增殖密切相关，常被作为细胞增殖标记物。本实验免疫组化结果显示，CA患者Ki-67除基底层有表达外，在那些没有分化能力的上层表皮结构亦有不同程度的表达，说明当HPV感染宿主细胞时，KCs增殖周期发生紊乱，表现在除有分化能力的KCs，那些没有分化能力的KCs亦有异常的增殖。我们对20例患者治疗前后疣体组织中的KCs增殖指标Ki-67表达水平进行比较，结果显示低剂量环磷酰胺联合胸腺肽治疗后Ki-67表达减少，提示该疗法治疗后疣体中KCs增殖能力降低，HPV感染后的KCs异常增殖状态得到有效抑制。临床上表现为CA疣体缩小或减少。

参与细胞凋亡过程的主要酶家族为Caspase，Caspase-3被激活后剪切产生活性片段Cleaved Caspase-3，这将激活半胱氨酸蛋白酶的粒酶B引入杀伤性T细胞，导致靶细胞凋亡。所以，Caspase-3在凋亡过程中起主导作用，这也是我们选取Cleaved Caspase-3作为细胞凋亡观察指标的原因。该疗法治疗后显示Cleaved Caspase-3表达增加，提示环磷酰胺联合胸腺肽治疗后疣体病理性增殖形成的KCs凋亡增加，加速向终末细胞分化，在角质层脱落死亡。

CA疣体局部中HPV病毒大量存在于棘层上部和颗粒层中的挖空细胞中，而在基底层中HPV含量很低[12]。HPV颗粒在感染表皮基底层细胞后，随着基底层细胞向上分化增殖的过程大量复制增殖，造成患处局部疣体形成。用原位杂交方法对治疗前后疣体内HPV病毒的变化及疣体表面HPV载量的变化进行探讨，结果显示治疗后疣体内HPV阳性细胞减少。进一步用实时定量PCR检测治疗前后患者疣体表面HPV6/11-DNA拷贝数，结果显示治疗后病毒载量明显低于治疗前。接触CA患者是否发病，很大程度上取决于接触者感染的病毒量。HPV表达的部分蛋白对局部细胞免疫有抑制作用，高载量的HPV对局部细胞免疫抑制作用相对较强，使机体难以抑制病毒复制。本实验结果显示治疗后病毒载量明显低于治疗前，提示低剂量环磷酰胺联合胸腺肽治疗能通过解除局部细胞的免疫抑制，有效清除HPV病毒。Che等[13]发现病毒载量随着复发次数以及病程的增加而升高，因此对于高载量病毒的患者，应早期进行综合治疗，尽可能降低病毒载量，这也与我们使用低剂量环磷酰胺联合胸腺肽治疗CA的思路一致。

基于以上研究结果显示的治疗后Ki-67阳性表达率下降，表达强度减弱，Cleaved Caspase-3阳性表达率升高，表达强度增强以及治疗后病毒载量下降，我们可以得出如下结论：该疗法治疗有效的机制与疣体中KCs增殖能力降低、凋亡增强及疣体HPV载量减少相关。这为低剂量环磷酰胺联合胸腺肽疗法治疗CA临床应用提供了一定的理论基础。提示今后对低剂量环磷酰胺联合胸腺肽疗法治疗CA机制的进一步研究，既可以聚焦于疣体中KCs的增殖与凋亡的具体分子机制，也可以聚焦于疣体内HPV载量减少的具体分子机制上。