天麻醇提取物灌胃对帕金森病大鼠认知功能障碍的改善作用及其机制

郭沛鑫，雷娜，吴海妹，李江蕊，苟向薇，解宇环

云南中医药大学，昆明 650500

帕金森病(PD)是一种常见的中老年中枢神经系统退行性疾病，随着人口的老龄化，PD已成为威胁人类健康的主要疾病[1]。PD主要病理变化是黑质致密部多巴胺能神经元缺失，多巴胺能神经功能相对减弱、胆碱能神经功能相对增强，导致患者出现运动减少、僵直、震颤等临床症状[2]。近年研究[3,4]发现，线粒体功能障碍、钙超载、铁离子的堆积、免疫炎症等均能造成氧化性损伤，促进多巴胺能神经元凋亡。抗氧化治疗为PD患者治疗的新方向。中药天麻为兰科天麻属植物天麻的根茎，有息风定惊、平肝潜阳等功效。近年，关于天麻抗PD的研究报道较多[5,6]，但天麻抗PD的物质基础研究却未见报道。研究[7,8]发现，天麻脂溶性成分有抗氧化、保护神经元细胞的作用，提示脂溶性成分可能是天麻抗PD的药效物质基础。2018年4～5月，本研究通过用95%乙醇提取天麻脂溶性成分(即天麻醇提取物)，观察天麻醇提取物对PD大鼠认知障碍的改善作用,并探讨其机制，为指导天麻治疗PD的临床合理用药和开发新药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 120只SD雄性大鼠，清洁级，体质量250～350 g，由四川医学科学院实验动物研究所提供，动物合格证号：SCXK(川)2013-12，自由饮食、普通光照饲养于云南中医药大学动物实验中心。美多巴购于上海罗氏制药有限公司，批号：SH2061；6-OHDA购于Sigma公司，批号：1002007845；盐酸去水吗啡购于Sigma公司，批号：1001753747；脂质过氧化物(LPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)测试盒均购自南京建成生物工程研究所。68001型脑立体定位仪购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；YP10001电子称购于上海越平科学仪器有限公司；FA1004型分析天平购于昆明安普科技有限公司；J.J-2A/LC1017-2A双通微量注射泵购于上海寰熙医疗器械有限公司；DFY-200摇摆式中药粉碎机购于温龄市林大机械有限公司；ZDHW调温电热套购于北京中兴伟业仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵购于郑州长城科工贸有限公司；CA-1111冷却水循环装置购于上海爱明仪器有限公司；OSB-2000旋转蒸发仪购于上海爱明仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅购于国华电器有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱购于上海一恒科技有限公司；63003型Morris水迷宫购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司；M200PRO酶标仪购于北京博宇腾辉科贸有限公司。

1.2 天麻醇提取物的制备 由本实验室自制。制法：用摇摆式中药粉碎机将天麻打粉至粗粉，用电子称称取天麻粗粉放入圆底烧瓶，加入5倍量95%乙醇回流2 h，抽滤；滤渣加5倍量95%乙醇继续回流1 h，抽滤；随后滤渣再加5倍量95%乙醇再回流1 h，抽滤。合并3次滤液，用旋转蒸发仪回收乙醇，将浓缩液转移至恒温水浴锅挥至浸膏状，放入电热恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重，即得天麻醇提取物。

1.3 PD大鼠模型的制作、动物分组及天麻醇提取物的给予方法 将SD雄性大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射进行麻醉，俯卧位固定于脑立体定位仪上，门齿低于耳杆2.3 mm，根据Paxson《The Rat Brain》图谱，用6-OHDA行脑立体定位注射，制作PD大鼠模型，方法为：将含0.2%抗坏血酸的6-OHDA溶液(浓度：5 μg/μL)分别注入右中脑腹侧被盖部(VTA，坐标为AP=-4.8 mm, ML=-1.2 mm, DV=-8.2 mm)和黑质致密部(SNc，坐标为AP=-4.8 mm, ML=-2.0 mm, DV=-8.0 mm)各4 μL，留针5 min，缓慢退针。伤口处涂抹硫酸庆大霉素，缝合。2周后腹腔注射盐酸去水吗啡0.5 mg/kg诱导大鼠向健侧转圈，以平均旋转圈数≥7 r/min的大鼠为造模成功大鼠[9]。取PD模型制作成功大鼠随机分为模型对照组(给予等体积蒸馏水)、美多巴组(7.8 mg/kg)、天麻醇提取物低剂量组(5 g生药/kg)、天麻醇提取物中剂量组(10 g生药/kg)及天麻醇提取物高剂量组(20 g生药/kg)，另取正常大鼠作为空白对照组(给予等体积蒸馏水)，每组8只。各组动物按上述剂量灌胃给药，1次/d，连续21 d。

1.4 各组大鼠神经行为学障碍程度评价 在给药期间每周进行1次行为学检测：腹腔注射盐酸去水吗啡(0.5 mg/kg)，记录注射5 min后30 min内各组大鼠恒定向健侧旋转的转圈数，每1个360度旋转计数1次。比较各组动物的转圈数，以此评价大鼠神经行为学障碍程度[10]。

采用水迷宫实验[11]评价神经行为学改善程度。Morris水迷宫为直径1.2 m、高0.9 m的圆形水池，水池内壁被漆为黑色，池内水深0.5 m，水温保持在(22±2)℃，房间内光照恒定，无光线直射在水池内。池壁上以4个等距离点将水池分为4个象限，在目标象限(设为3象限)内距离池壁35 cm处放有直径为10 cm高23 cm的圆形黑色站台，站台位于水面下2 cm。池壁内侧贴有不同形状的标记物。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。方法如下：①记忆训练期(第1、2天)：将大鼠面朝池壁放入水中游泳60 s，第1天引导其登上平台，第2天若在60 s内动物没有登上平台则继续引导其登上平台，停留15 s后放入温暖干燥的笼子结束训练。②记忆增强期(第3、4、5天)：每只动物每天早晚各1次实验，每次分别从除平台所在方位外的3个方位各放1次，每只动物放入水中的间隔时间为15 s。动物单次游泳时间为60 s，若大鼠在60 s内不能上台则引导其登上平台适应15 s后进行下次实验。最后将大鼠擦干放入鼠笼。③空间探索实验(第6天)：撤除平台，将大鼠从与平台相对的方位面朝池壁放入水中，让大鼠自由游泳60 s后将动物擦干放入鼠笼。观察大鼠在平台所在象限的距离百分比(PT%)和停留时间百分比(T%)，以此来评价药物对大鼠神经行为学障碍的影响(PT%和T%值越大，表明大鼠的认知记忆能力越强)。采用Smart2.0 Morris水迷宫视频分析系统进行信息处理。

1.5 各组氧化应激指标的检测 大鼠认知行为学测定后，以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射进行麻醉，腹主动脉取血，于4 000 r/min离心5 min，分离血清，分别按试剂盒的操作说明书测定大鼠血清LPO、GSH-Px、SOD、MDA。

2 结果

2.1 各组大鼠认知功能比较 与模型对照组比较，连续给药3周(21 d)，美多巴组大鼠转圈数先升高后降低;在第3周末，美多巴组、天麻醇提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组PD大鼠转圈数有降低趋势，但与模型对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，结果详见表1。与模型对照组比较，美多巴组、天麻醇提取物高剂量组在水迷宫的PT%和T%明显增加(P均<0.05),见表2。

表1 各组给药前后大鼠转圈数 (圈，

表2 各组大鼠PT%、T% 比较

2.2 各组血清LPO、GSH-Px、SOD、MDA含量比较 与空白对照组比较，模型对照组血清中LPO、MDA含量升高，血清GSH-Px、SOD含量降低(P<0.01)。与模型对照组比较，天麻醇提取物高剂量组大鼠血清中LPO含量降低(P<0.05),天麻醇提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组血清中GSH-Px、SOD含量升高、 MDA含量降低(P<0.05或<0.01)，详见表3。

3 讨论

PD患者常伴随着认知功能障碍和氧化应激的发生。在评价认知功能障碍的指标里，我们选择了盐酸去水吗啡(APO)所诱导的PD大鼠旋转实验和水迷宫实验。首先，在PD大鼠认知功能障碍的评价上，APO诱发旋转实验是目前最重要的评价指标。APO是一种D2受体激动剂,而6-OHDA是一种类似于去甲肾上腺素的化学制剂，具有较强的神经毒性。本实验利用立体定位仪，参考大鼠的大脑立体图谱，将6-OHDA定位注射到大鼠尾壳核CPU破坏黑质-纹状体多巴胺系统，使动物毁损侧黑质多巴胺能神经元缺失、受损，导致纹状体多巴胺含量降低，造成多巴胺和乙酰胆碱神经递质失衡，从而胆碱能神经功能相对亢进，表现为PD样的症状[12,13]。此时，机体反射性地认为受损侧脑区多巴胺受体数量不足，不足以结合足够的多巴胺，以平衡乙酰胆碱的功能。因此在受体调节机制下，同侧(受损侧)D2受体出现上调，产生超敏感现象，当给予APO激动D2受体后则产生比健侧更强的多巴胺活性，因为同侧脑区控制对侧躯体的运动，故而表现为向健侧的旋转。给药后，因平衡了脑内递质多巴胺和乙酰胆碱水平，受损侧脑区受体逐渐下调恢复正常，但因为受体下调恢复正常是一个缓慢的过程，所以在给药21 d的过程中，我们仅在给药第3周观察到大鼠的转圈数有下降趋势，提示天麻醇提取物能缓慢改善PD大鼠神经行为学障碍(阳性药美多巴甚至在给药的第1周和第2周有增加大鼠转圈数的现象出现，这与美多巴是D2受体激动剂，在初期能增加大鼠的旋转圈数有关)。其次，在Morris水迷宫实验中，通过比较大鼠PT%和T%评估动物的空间学习记忆能力，二者的数值越大说明动物的空间认知记忆越好。实验结果进一步表明，天麻醇提取物高剂量能明显增加PD大鼠PT%和T%，提示天麻醇提取物能增强PD大鼠的认知记忆能力，改善神经行为学障碍。

表3 各组血清LPO、GSH-Px、SOD、MDA比较

在以往的研究中，有证据表明，氧化应激-PD-神经保护三者密切相关。氧化应激在促进PD疾病发生、发展中起着重要作用[14]。机体内过量的自由基对机体损伤的重要原因是产生LPO;SOD是机体内重要的抗氧化酶，它能有效清除生物氧化产生的超氧阳离子自由基，并有终止自由基连锁反应的作用；MDA为脂质过氧化物终产物之一，其含量多少能体现机体的脂质过氧化程度，从而反映神经元受损的程度[15]。在抗氧化应激指标中，谷胱甘肽(GSH)是大脑中存在的最为丰富的可溶性抗氧化分子，大量存在于神经元、胶质细胞和星型胶质细胞中，发挥重要的解毒剂作用[16]。GSH在黑质和纹状体区域的水平与PD症状的严重程度相关，在严重患者中GSH水平几乎下降为零。GSH的损耗严重影响多巴胺神经元的生存，研究显示突触核蛋白基因突变与PD 的发生密切相关，而α-突触核蛋白的形成与氧化型GSH的增加呈正相关[17]。GSH-Px能特异地催化还原型GSH对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用[18]。本实验表明，与模型对照组比较，天麻醇提取物高剂量组大鼠血清中LPO含量降低；天麻醇提取物低剂量组、中剂量组和高剂量组血清SOD、GSH-Px值均升高， MDA值降低。提示天麻醇提取物具有明显的抗氧化作用，可通过清除脑内的脂质过氧化物，减轻神经元细胞的氧化损伤，达到神经保护的作用，这可能是其改善PD大鼠认知功能障碍的机制之一。