基于蛋白芯片技术的多囊卵巢综合征患者卵泡液差异蛋白的研究

蒋毅弘，廖 宇，岳 江，黄 融，刘 伟

上海交通大学医学院附属仁济医院内分泌代谢科，上海200127

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种复杂的内分泌代谢性疾病，在育龄期女性中的患病率为4%～10%[1]。PCOS 的主要临床表现为稀发排卵或不排卵、高雄激素血症和卵巢多囊样变[2-3]。PCOS 女性患者除了生育能力降低，还通常合并肥胖、胰岛素抵抗、糖脂代谢异常和心血管疾病[3-4]。

卵泡液由颗粒细胞、卵泡膜细胞和卵母细胞的分泌物以及血浆蛋白通过卵泡膜毛细血管基膜扩散组成，主要成分为蛋白质、类固醇激素、多糖和代谢物等[5]。卵泡液为卵母细胞的发育提供了微环境，并对卵泡发育过程中卵子和卵泡细胞的通讯起到媒介作用。卵泡液蛋白质成分的改变可以反映出病理状态下卵泡细胞分泌过程和血浆组分的变化[6]。

近年来，蛋白质组学的兴起对PCOS 的发病机制、生物标志物、药物治疗靶点和预防远期并发症提供了新的见解。与传统的蛋白质组学技术如双向凝胶电泳和质谱分析相比，蛋白抗体芯片技术具有高通量、快捷、高灵敏度等特点[7-8]。目前，关于PCOS 患者卵泡液的蛋白质组学研究甚少。本研究采用AAH-BLG-507 蛋白芯片，对PCOS 患者和非PCOS 患者卵泡液标本进行检测，筛选差异表达蛋白，并对差异蛋白进行生物信息学分析，以期为PCOS 的诊断以及发病机制和远期并发症的研究提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

PCOS 组纳入于上海交通大学医学院附属仁济医院生殖中心就诊的拟行体外受精/卵胞质内单精子显微注射-胚胎移植助孕的6 例正常体质量指数（body mass index，BMI）PCOS 患者，平均年龄（30.67±3.67）岁，BMI（23.12±2.77）kg/m2，胰岛素抵抗指数（HOMAIR）为1.84±0.38；以6 例年龄、BMI 匹配的非PCOS 女性患者为对照组，平均年龄（30.00±2.83）岁，BMI（21.84±2.15）kg/m2，HOMA-IR 为1.27±0.37。

PCOS 组患者诊断采用2003 年鹿特丹标准（以下3项中满足2 项及以上即诊断为PCOS）[2]：①月经稀发或无排卵。②有高雄激素的临床表现和/或高雄激素血症。③B 超检查见一侧或双侧卵巢直径2 ～9 mm 的卵泡≥12个和/或一侧卵巢体积≥10 cm3。同时，排除先天性肾上腺皮质增生、分泌雄激素的肿瘤、库欣综合征、甲状腺功能异常、高泌乳素血症、2 型糖尿病等其他疾病。

对照组纳入年龄、BMI 匹配的女性患者，因输卵管原因或男方原因导致不孕，排除其他内分泌疾病（甲状腺功能异常、高泌乳素血症等），且近6 个月内未使用免疫调节、细胞毒性、细胞因子及激素类药物。

本研究得到医院伦理委员会的批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 蛋白芯片和仪器

Raybiotech 试剂盒（RayBio Biotin Label-based Human Array 1，AAH-BLG-507 芯片；Raybiotech 公司，美国），由上海华盈生物医药科技有限公司协助完成操作；芯片扫描仪（GenePix 4000B，Axon 公司，美国）；GenePix Pro 6.0 软件（Axon 公司，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 卵泡液收集 采用标准促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）拮抗剂促排卵方案：月经周期第3 天起予以重组人促卵泡素，当至少有1 个卵泡的直径≥12 mm 时予以皮下注射GnRH 拮抗剂250 µg/d 直至卵泡发育成熟。当至少有1 个优势卵泡直径≥18 mm时予以肌内注射人绒毛膜促性腺激素4 000 ～8 000 IU，36 h 后经阴道超声引导下穿刺取卵。收集未被血液污染的优势卵泡液，室温400×g 离心5 min，收集上清液并于-80 ℃冰箱冻存。

1.3.2 蛋白芯片检测方法 所有实验操作均严格按照Raybiotech 试剂盒说明书的标准操作流程进行。每例卵泡液样本取20 µL，5 倍稀释（20 µL 卵泡液+80 µL 浓度磷酸缓冲液，总体积100 µL）后加入透析管中，置于500 mL 浓度磷酸缓冲液 （磷酸缓冲液，pH 值8.0）的透析液中4 ℃过夜透析。透析后，每个样本取35 µL，加入标记缓冲液至终体积190 µL，再加入22 g/L 使用浓度磷酸缓冲液（pH 值8.0）稀释的标记试剂进行生物素标记。室温震荡30 min，在上述反应液中加入3 µL 终止液，进行第二次透析。蛋白芯片的每块板（Block）加入800 µL 浓度封闭缓冲液，室温封闭30 min。移除封闭缓冲液，每块板加入400 µL 生物素标记过的卵泡液样本（用封闭液20 倍稀释后）。移除样品，先后加入浓度洗液I 和浓度洗液Ⅱ洗涤。再加入荧光标记链霉亲和素，室温孵育2 h。移除荧光标记链霉亲和素，再次洗涤。最后将蛋白芯片放入GenePix 4000B 芯片扫描仪进行扫描，使用GenePix Pro 6.0 软件读取数据。

1.3.3 蛋白芯片数据处理和差异表达蛋白的筛选 12 例样本经GenePix Pro 6.0 软件解读，获得的荧光信号值包括荧光信号和背景等。去除背景的荧光信号后获得507 个细胞因子的荧光信号值，数据经过归一化处理后进行分析。以PCOS 组荧光信号均值/对照组均值计算差异倍数（fold change，FC），以1.5 倍调变为阈值（FC>1.5 或FC<0.67）筛选差异表达蛋白。

1.3.4 差异蛋白的生物信息学分析 使用人类蛋白质参考数据库（Human Protein Reference Database，HPRD；http://www.hprd.org/）对差异蛋白的亚细胞定位、分子功能和生物过程进行注释[9]。运用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov）和KEGG 数据库（http://www.kegg.jp）进行KEGG 通路分析[10-11]。使用STRING 数据库（http://string-db.org/）进行差异蛋白的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络分析[12]，并利用Cytoscape 软件（https://cytoscape.org/）进行可视化。进一步使用cytoHubba 插件根据每个蛋白节点的度（degree）值排序，蛋白的度值越高表明该蛋白与越多的其他蛋白存在互作；将度值最高的前10 个蛋白视为PPI 网络中重要的蛋白，即核心蛋白。

2 结果

2.1 蛋白芯片检测和差异表达蛋白谱的建立

2 组卵泡液样本采用AAH-BLG-507 蛋白芯片检测获得荧光信号结果。去除背景后的荧光信号值经归一化处理后计算FC 值。以1.5 倍调变为阈值（FC>1.5 或FC<0.67），筛选获得对照组和PCOS 组卵泡液差异表达蛋白74 个，其中表达上调25 个，表达下调49 个（表1）。表达上调最显著的蛋白为CC 趋化因子配体24（C-C motif chemokine ligand 24，CCL24）、CXC 趋化因子受体3（C-X-C chemokine receptor 3，CXCR3）和CC 趋化因子配体28（CCL28），三者均属于趋化因子/受体家族，在机体的免疫应答和免疫调节中发挥重要作用。表达下调最显著的蛋白为白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和Wnt 信号通路抑制因子（Dickkopf-1，DKK1），两者参与细胞增殖、组织修复和胚胎发育等生理过程。

表1 PCOS 患者卵泡液的差异表达蛋白Tab 1 Differential expressed proteins identified from follicular fluid of women with PCOS

2.2 差异蛋白的功能注释分析

图1 卵泡液中差异蛋白的分类Fig 1 Categorization of differential proteins in follicular fluid

将筛选出的74 个差异表达蛋白根据HPRD 网站进行功能注释。根据亚细胞定位，大多数蛋白（52%）位于胞外区，其次为质膜区（35%），见图1A。根据分子功能，19%和14%的蛋白分别与细胞因子活性和趋化因子活性相关，其余主要的蛋白功能为受体活性（11%）、生长因子活性（10%）和G 蛋白偶联受体活性（7%），见图1B。根据参与的生物学过程，大多数蛋白（57%）参与细胞通讯和信号转导，其次为免疫应答（20%）和蛋白质代谢（12%），见图1C。

2.3 差异蛋白的KEGG 分析

对74 个差异表达蛋白进行KEGG 通路分析，结果显示，富集到的蛋白数最多的3 条通路为细胞因子间受体相互作用通路（P=5.48×10-37）、趋化因子信号通路（P=1.27×10-12）和JAK-STAT 信号通路（P=2.79×10-7）。图2 展示了分别富集到36 个蛋白（48.65%）和17 个蛋白（22.97%）的细胞因子间受体相互作用通路和趋化因子信号通路。

图2 差异蛋白富集所得的KEGG 通路Fig 2 KEGG pathway enriched by differential proteins

2.4 差异蛋白的PPI 网络分析

运用STRING 软件进行差异蛋白的PPI 网络分析，并将结果在Cytoscape 软件中进行可视化（图3）。使用cytoHubba 插件对蛋白节点的度值进行排序，度值前10 的核心蛋白从高到低分别为CCR7、CXCR3、CCR1、CXCR2、CXCR1、IL10、KNG1、IL4、CXCL11、CX3CL1（图4），其中CCR7、CCR1、CXCR2、CXCR1、IL10、KNG1、IL4、CXCL11 在PCOS 患者卵泡液中表达下调，CXCR3 和CX3CL1 表达上调（图3）。

图3 差异蛋白的蛋白互作网络图Fig 3 PPI network of differential proteins

图4 蛋白互作网络中的核心蛋白Fig 4 Hub proteins of PPI network

3 讨论

PCOS 是一种复杂的临床异质性疾病，PCOS 女性罹患2 型糖尿病和心血管疾病的风险更高。越来越多的研究表明慢性低度炎症不仅与PCOS 发病机制相关，还与胰岛素抵抗、远期代谢性疾病及心血管并发症相关[13]。近年来，蛋白质组学技术的兴起为疾病的基础研究提供了高效的技术平台。与传统的靶向技术相比，蛋白质组学技术更适合PCOS 这种异质性疾病，因其能得到更加完整和全面的代谢及代谢谱改变信息[14]。

既往关于PCOS 患者卵泡液的蛋白质组学研究主要采用质谱分析、液相色谱-串联质谱和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等技术，鲜有使用蛋白芯片技术筛选PCOS 患者卵泡液中的差异表达蛋白。研究表明，PCOS患者卵泡液中的差异蛋白及其涉及的通路与胰岛素功能调节、脂代谢、炎症反应和卵泡的生长发育有关[15-17]。Ambekar 等[15]选取的PCOS 患者平均BMI 水平处于超重范围；尚无关于非超重/肥胖的PCOS 患者卵泡液差异蛋白的研究。故本研究选取正常BMI 水平的PCOS 患者为研究对象，采用AAH-BLG-507 蛋白芯片技术，观察其与BMI 匹配的非PCOS 患者卵泡液中细胞因子的表达变化。

通过比较6 例PCOS 患者和6 例非PCOS 患者卵泡液中507 种细胞因子的表达水平，筛选出74 个差异蛋白，其中表达上调25 个，表达下调49 个。功能注释分析结果显示，差异蛋白主要的分子功能为细胞因子活性和趋化因子，参与的生物学过程为细胞通讯、信号转导和免疫应答。KEGG 通路分析指出，富集到的通路主要涉及细胞因子间受体相互作用和趋化因子信号通路。进一步的PPI 网络分析和核心蛋白筛选的结果显示，核心蛋白的类型主要为趋化因子及其受体。

趋化因子是一类具有细胞因子活性的小蛋白家族，能将免疫系统中的细胞募集到感染或组织损伤部位，并在免疫应答的不同阶段调节免疫细胞的激活状态。既往研究显示，部分趋化因子家族成员与PCOS 相关：非超重PCOS女性血清中单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1/CCL2）水平较正常女性升高[18]；PCOS患者血清趋化因子CX3C 配体1（chemokine CX3C motif ligand 1，CX3CL1）水平升高，升高的CX3CL1 水平与胰岛素抵抗、慢性炎症和雄激素水平相关[19]；此外，PCOS患者血清 趋化因子CXC 配体11（CXCL11）、趋化因子CXC 配体4（CXCL4）、单核细胞趋化蛋白-4（MCP-4/CCL13）等趋化因子水平还与性激素水平存在相关性[20]。

PCOS 女性不仅生育能力受损，发生肥胖、胰岛素抵抗、2 型糖尿病、脂代谢紊乱和心血管疾病的风险也进一步增加[1,3-4]。胰岛素抵抗是PCOS 的核心发病机制之一。与BMI 匹配的对照组相比，肥胖和非肥胖PCOS 组患者的胰岛素抵抗都更为严重[21-22]。目前，已有越来越多的证据显示趋化因子及其受体与肥胖、胰岛素抵抗和慢性炎症相关。CC 趋化因子受体7（C-C chemokine receptor type 7，CCR7）主要在免疫细胞上表达，CCR7 及其配体通过在T 细胞和树突状细胞间的相互作用是天然免疫和获得性免疫间的桥梁[23]。研究[24]显示，CCR7-/-小鼠的糖耐量和胰岛素敏感性显著降低，肝脏脂肪变性更严重。CC 趋化因子受体1（CCR1）在人单核细胞、巨噬细胞和T 细胞上表达，CCR1 通过防止过多的T 细胞和单核细胞流入动脉粥样硬化的血管壁，具有抗动脉粥样硬化作用[25]。CXC 趋化因子受体1（CXCR1）和CXC 趋化因子受体2（CXCR2）是白介素8 的受体，使用两者的阻断剂能改善db/db 小鼠的糖耐量、胰岛素抵抗和肝脏脂肪沉积，且CXCR2-/-小鼠能够免受肥胖诱导所致的胰岛素抵抗[26-27]。CXCL11 水平在肥胖患者中显著升高，通过抑制内脏脂肪的血管生成在肥胖患者中促进了脂肪沉积[28]。CXCR3通路在内脏脂肪组织的炎症反应中起着重要作用。与高脂喂养（high fat diet，HFD）的野生型小鼠相比，HFDCXCR3-/-小鼠的空腹血糖水平更低，糖耐量更高，单核细胞内脏脂肪浸润和巨噬细胞炎症程度较轻[29]。CX3CL1是CX3C 趋化因子家族中的唯一成员，能调节单核细胞对脂肪细胞的黏附，与肥胖、胰岛素抵抗和2 型糖尿病相关[30]。可见，上述趋化因子/受体在糖脂代谢、炎症和胰岛素抵抗中发挥重要的调节作用。卵泡液中CCR7、CCR1、CXCR3 和CX3CL1 的表达变化也可能参与PCOS患者卵巢局部的代谢和慢性炎症的调节。肥胖小鼠或人体中CXCR1、CXCR2 和CXCL11 的表达变化趋势与PCOS患者卵泡液中相反，可能与卵泡液和血清样本的不同有关（卵泡液主要反映卵巢局部细胞因子合成和分泌的变化），也可能与本研究纳入的是非肥胖患者有关。PCOS 患者卵泡液中趋化因子/受体及其相关信号通路表达的变化可能导致卵泡液局部的慢性低度炎症和胰岛素抵抗，促进卵泡膜细胞分泌更多的雄激素和影响颗粒细胞功能，最终导致卵泡发育异常。

除趋化因子家族外，本研究发现2 种抗炎细胞因子白介素10（interleukin，IL-10）和白介素4（IL-4）在PCOS女性的卵泡液中表达下调。IL-10 通过Th1 细胞和巨噬细胞下调促炎细胞因子的表达。既往研究也显示，PCOS 女性卵泡液中的IL-10 水平较正常女性降低，促炎和抗炎细胞因子的不平衡会导致类固醇激素生成改变，卵泡成熟延迟和卵巢功能障碍[31]。IL-4 参与调控糖脂代谢，IL-4 在改善胰岛素敏感性和糖耐量的同时能抑制脂质的堆积[28]。

综上，运用蛋白芯片技术能够建立PCOS 卵泡液差异表达蛋白谱，筛选所得的差异蛋白涉及细胞因子间受体相互作用和趋化因子信号通路，可能与卵泡液局部的胰岛素抵抗和慢性低度炎症相关，进而影响卵泡的生长发育，对PCOS 的早期诊断、发病机制和并发症的研究具有一定的提示作用。本研究是一个小样本量的蛋白质组学研究，筛选所得的差异表达蛋白有待于进一步扩大样本量并定量测定来验证，在更深入地理解PCOS 的发病机制、预防心血管代谢并发症，以及寻找新的诊疗方面具有潜在的应用 价值。

参·考·文·献

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