罗非鱼鱼皮胶原蛋白酶法提取工艺及特性研究

王 晴，钱玉梅，李红侠，陈红玲

(1.宿州学院，安徽 宿州 234000； 2. 宿州市天然产物与功能性食品工程技术研究中心，安徽 宿州 234000)

0 引言

近些年来，我国渔业发展迅速，已跻身于全球第一渔业大国，在加工生产过程中不可避免地产生鱼皮、鱼鳞、鱼鳔等废弃物，这些废弃物的充分利用可以提高渔业加工的附加价值，增加经济效益，反过来促进渔业的发展[1-2]。经研究表明鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，胶原蛋白是一种白色不透明无支链的纤维状蛋白质，广泛应用于医药、化妆品和食品工业中，例如功能食品、食品添加剂、食品包装材料等[3]，因此以水产加工废弃物鱼皮为原料制备胶原蛋白具有广阔的开发前景。以罗非鱼鱼皮为材料，采用胃蛋白酶法提取，利用单因素和正交试验优化胃蛋白酶酶法提取的最优条件，并对胃蛋白酶法提取的胶原蛋白的溶解性能和保水性能进行研究，为水产胶原蛋白的进一步应用提供依据，以期提高渔业的附加价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼鱼皮(广东湛江水产有限公司)、胃蛋白酶、无水乙醇、氯化钠、硫酸铜、氢氧化钠、硫酸、氯胺T、乙酸等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)等。

1.2 仪器与设备

SP-723分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、GL-23M高速离心机(湖南湘仪集团)等。

1.3 试验方法

1.3.1 罗非鱼鱼皮的预处理

将去鳞鱼皮剪碎(约3 × 3 mm)，用 0.1 M NaOH溶液浸泡24 h，以去除脂肪和部分杂蛋白，然后洗至中性，再用正己烷浸泡脱脂24 h，真空冷冻干燥后，粉碎(10目)[4]。

1.3.2 胃蛋白酶法提取鱼皮胶原蛋白单因素试验

将粉碎后的鱼皮置于含有胃蛋白酶(200 U/mg)的预冷0.5 M乙酸溶液中，调节pH，并于水浴锅中在一定温度下连续搅拌提取一定时间，取上清，缓慢加入NaCl至最终浓度0.9 M，盐析过夜，然后2 500 g离心30 min，弃上清，将沉淀溶解于含1.0 M NaCl的Tris-HCl缓冲液中，再次于20 000 g离心1 h，取上清透析脱盐48 h得到胶原蛋白提取液[5]。

1.3.3胶原蛋白提取率测定

羟脯氨酸含量按GB/T 9695.23-2008测定，胶原蛋白提取率含量按下式计算[4]：

其中，X——胶原蛋白提取率，%；c——羟脯氨酸含量；11.1——换算系数.

1.3.4正交试验

以单因素结果为依据建立因素水平表(表1)，以胶原蛋白提取率为评判指标，按照L9(34)正交表来进行试验优化方案的设计。

表1 正交试验因素水平设计表

1.3.5 溶解性测定

酶解提取的胶原蛋白冷冻干燥，取一定质量溶于0.5 mol/L醋酸中，使得浓度为5 mg/mL。取5 mL分别调至pH为2、3、4、5、6、7、8、9，保持pH值不变，蒸馏水定容至10 mL， 4000 r/min离心15 min，，双缩脲法测定上清液蛋白质含量，并同时将样品溶于0.5 mol/L醋酸溶液，采用双缩脲法测定样品总蛋白含量，用公式(1)计算溶解性[6]。

(1)

1.3.6 保水性测定

量取50 mL蒸馏水，加入冻干后的胶原蛋白 0.05 g，搅拌，置于1000 r/min条件下离心5 min，弃分离水，称量残留物质量，并置于25℃干燥箱中，每隔20 min测一次质量，按公式(2)计算水分残存率[6]，以测定其保水性强弱。

(2)

式中：Y表示水分残存率%；m0表示离心剩余物质量/g；m表示每隔一段时间剩余物质量/g。

2结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1提取时间对胶原蛋白提取率的影响

设置酶解温度40℃，料液比1:70，pH 3，酶解时间分别为5、10、15、20、25 h时，胶原蛋白的提取率如图1所示，当提取时间较短时，胶原蛋白尚未被完全酶解，故随着时间的延长，胶原蛋白与酶能够充分结合，反应速率加快，胶原蛋白的酶解量不断增大，胶原蛋白提取率也不断增加，但当胶原蛋白提取率上升到某一极限值后，再延长提取时间则对胶原蛋白提取率影响较小[7]。因此，从使胶原蛋白充分被酶解且节省时间的角度考虑，最适宜提取时间选取15 h。

图1 提取时间对胶原蛋白提取率的影响 图2 提取温度对胶原蛋白提取率的影响

2.1.2提取温度对胶原蛋白提取率的影响

设置酶解时间15 h，料液比1:70，pH 3，酶解温度分别为40、45、50、55、60、65℃时，胶原蛋白的提取率如图2所示，在35～50 ℃时，胶原蛋白提取率随温度的上升持续增加，但当温度超过50 ℃，胶原蛋白提取率出现下降，因为温度过高，不利于胃蛋白酶活性的发挥，致使其酶解作用减弱[8]。因此，最适提取温度选用50 ℃。

2.1.3料液比对胶原蛋白提取率的影响

设置酶解时间15 h，酶解温度50 ℃，pH 3，料液比分别为1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90 g/mL时，胶原蛋白的提取率如图3所示，料液比位于1:40至1:70之间，胶原蛋白提取率不断上升，料液比为1:80时，胶原蛋白提取率开始下降，可能由于当液料比低于1:70时，胶原蛋白酶解时溶剂不充足，当料液比大于1:70时，溶剂开始过量，此时酶解液稀释，胶原蛋白提取率反而降低[9]，因此料液比选为1:70。

2.1.4 pH对胶原蛋白提取率的影响

设置酶解时间15 h，酶解温度50 ℃，料液比1:70，pH分别为1、2、3、4、5、6时，胶原蛋白的提取率如图4所示，pH小于3时，胶原蛋白提取率随酸性减少而增加，当pH值增加到3时，胶原蛋白提取率最大，随后便随着酸性减少而减低。且酸性越低降低越迅速，表明pH值过低或过高均会对胃蛋白酶的活性有所抑制，可能通过影响胃蛋白酶分子的构象、解离状态及胶原蛋白的解离状态，进而影响胃蛋白酶活力和酶解反应速率，另一方面，较高的pH可能引入更多的杂质离子，污染反应环境[10]。所以，胃蛋白酶提取胶原蛋白的最适pH为3。

图3 料液比对胶原蛋白提取率的影响 图4 pH对胶原蛋白提取率的影响

2.2 正交试验结果

如表2所示，四个因素主次顺序为A>B>C>D，最优条件组合为A2B2C1D1，即最佳的提取条件为酶解时间15 h、酶解温度50 ℃、料液比1:60、pH为2。按照最优条件进行验证试验，测得胶原蛋白提取率为90.3%，高于表2中各组合的胶原蛋白提取率，说明了该方法可靠定，因此可用于优化胃蛋白酶酶解提取胶原蛋白的最佳提取工艺条件。

表2 正交试验结果

2.3 酶法提取胶原蛋白特性分析

2.3.1罗非鱼鱼皮胶原蛋白溶解性能

从图5可以看出，随着pH值的上升，罗非鱼鱼皮胶原蛋白的溶解度呈现持续下降趋势，在酸性条件下溶解性能大于碱性，且酸性越高，溶解性能越好，pH在3以下，胶原蛋白溶解度达70%以上，当pH超过3，溶解性能开始迅速下降，中性条件下，溶解性能仅为25%左右。胶原蛋白溶解性随 pH 的变化跟其等电点位置有关，当处于等电点，两性离子达到电荷平衡，溶解度达到最低，因此结果表明罗非鱼鱼皮胶原蛋白等电点位于7 附近。

图5 罗非鱼鱼皮胶原蛋白溶解性能 图6 罗非鱼鱼皮胶原蛋白保水性能

2.3.2罗非鱼鱼皮胶原蛋白保水性能

由图6可以看出，胃蛋白酶法提取的罗非鱼鱼皮胶原蛋白水分残存率随时间增加现迅速后缓慢降低，但在360 min后仍保持在90%以上，可见其保水性能较好，可能由于胃蛋白酶酶切位点使得胶原蛋白暴露了较多的亲水基团。

3 结论

研究了酶解时间、酶解温度、料液比、pH对胃蛋白酶提取罗非鱼鱼皮胶原蛋白提取率的影响，得到最佳酶解条件：酶解时间15 h、酶解温度50 ℃、料液比1:60、pH为2时，胶原蛋白提取率高达90.3%，该法提取的胶原蛋白溶解性能及保水性能较好，本研究为渔业资源的有效利用及胶原蛋白的进一步开发利用提供了理论依据。