西红花苷对子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞生长周期的影响及机制研究

周江妍　宋晓园　徐黎贤

[摘要] 目的 研究西紅花苷对子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞生长周期及凋亡的影响，从细胞水平初步探讨西红花苷在子宫腺肌病中的治疗作用。 方法 2018年1～6月收集江西省妇幼保健院术后病理确诊为子宫腺肌病标本，不同浓度西红花苷（0、200、300、400、500 μg/mL）作用于异位子宫内膜间质细胞后，分别在培养0、24、48、72、96 h取出，CCK-8法检测细胞增殖; Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;PI单染检测细胞周期。 结果 CCK-8法检测西红花苷浓度分别为200、300、400、500 μg/mL作用细胞72 h后，细胞抑制率分别为（7.60±0.03）%、（11.50±0.10）%、（18.26±0.14）%、（20.62±0.09）%，浓度为400 μg/mL、500 μg/mL组增殖抑制率明显高于浓度为200 μg/mL组，结果显示不同浓度西红花苷对子宫腺肌病异位内膜细胞增殖有明显抑制作用，与药物浓度及时间呈正比，随着西红花苷浓度的升高和作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率也越高;不同浓度西红花苷作用细胞48 h后，流式细胞术检测到子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞凋亡率随浓度的增加而增大，细胞周期G0/G1期比例增多。 结论 西红花苷在体外能显著抑制子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞增殖，诱导凋亡，使细胞周期阻滞在G0/G1期，这些结果在细胞水平上显示西红花苷可用于临床治疗子宫腺肌病。

[关键词] 子宫腺肌病;间质细胞;西红花苷;细胞增殖;凋亡

[中图分类号] R711.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）23-0045-05

Impacts and mechanism study of crocin on the growth cycle of ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis

ZHOU Jiangyan1   SONG Xiaoyuan2    XU  Lixian1

1.Department of Gynecology， Jiangxi Maternal and Child Health Hospital， Nanchang   330006， China; 2.Department of Chemical Medicine， Ganzhou Institutes for Food and Drug Control in Jiangxi Province， Ganzhou   341000， China

[Abstract] Objective To explore the impact of crocin on the growth cycle and apoptosis of ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis， and to preliminarily investigate the therapeutic effect of crocin on adenomyosis from cells level. Methods From January to June 2018， specimens of adenomyosis confirmed by postoperative pathology in Jiangxi Maternal and Child Health Hospital were collected. After crocin （0， 200， 300， 400， 500 μg/mL） of different concentrations performed on ectopic endometrial stromal cells， they were taken out after 0，24，48，72，96 hours of culture respectively，and cell proliferation was detected by CCK-8 method. Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry was used to detect cell apoptosis. PI single staining was used to detect cell cycle. Results The cell inhibition rates were（7.60±0.03）%， （11.50±0.10）%， （18.26±0.14）%， （20.62±0.09）%， respectively after different concentrations of crocin of 200， 300， 400， 500 μg/mL applied to the cells for 72 h detected by the CCK-8 method. The proliferation inhibition rate of 400 μg/mL、500 μg/mL were significantly higher than that of the 200 μg/mL group. The results showed that crocin of different concentrations had obvious inhibition effect on the proliferation of ectopic endometrial cells of adenomyosis，which was proportional to the drug concentration and time. The higher of crocin concentration and the longer of acting time， the higher of the cell proliferation inhibition rate. 48 hours after crocin at different concentrations acted on cells， flow cytometry detected that with the increase of concentration， the apoptosis rate of ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis increased and the G0/G1 phase ratio of cell cycle increased. Conclusion Crocin can significantly inhibit proliferation of ectopic endometrial stromal cells of adenomyosis in vitro， induce apoptosis， lead cell cycle to G0/G1 phase， suggesting from cell levels that crocin can be used for clinical treatment of adenomyosis.

[Key words] Adenomyosis; Stromal cells; Crocin; Cell proliferation; Apoptosis

子宫腺肌病是子宫内膜腺体和间质细胞向肌层浸润并弥漫性生长的良性疾病，其发病率有逐渐增高的趋势，已成为人们日益重视的妇科难治症之一[1]。目前其病因尚不明确，发病机制复杂，临床表现为痛经进行性加重、子宫增大、月经量过多、经期延长等，严重影响广大妇女的生活质量及身心健康[2-4]。在治疗上西医包括药物治疗、手术及介入治疗，除子宫全切术的根除性手术治疗外，其他方法治疗后的疗效不甚满意，且复发率高，副作用大，患者难以接受。子宫腺肌病属中医的“痛经”、“癥瘕”等范畴，而中医药在治疗痛经、癥瘕等方面有显著的优势和特色，不需手术且副作用小，患者容易接受。西红花苷是活血化瘀中药，具有疏经活络、通经化淤、散郁开结、消肿止痛的功效，常用于妇科治疗[5]。西红花苷是西红花中分离的有效单体成分之一，具有抗肿瘤活性，能高度抑制多种肿瘤细胞的生长，而不影响正常细胞的生长繁殖，在抗肿瘤的药理作用上可能是多靶点多途径的，如诱导癌细胞凋亡，抑制恶性增殖，影响细胞周期及分化、抑制炎性因子表达，控制多药耐药性等[6，7]。目前还没有西红花苷对子宫腺肌病影响的研究报道，本文旨在细胞水平上探索西红花苷对子宫腺肌病的作用，为临床治疗子宫腺肌病提供理论基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

1.1.1 组织标本  2018年1～6月收集江西省妇幼保健院术后病理确诊为子宫腺肌病標本5份，患者年龄35～50岁，月经规律。入选标准：术前6个月内未接受任何激素治疗;术前6个月内无妊娠及哺乳史;无甲亢、甲减等代谢性疾病;无高血压、糖尿病、心脏病等慢性疾病;近2周未服用激素类药物。排除标准：绝经、急、慢性炎症性疾病，合并卵巢子宫内膜异位囊肿、免疫系统疾病及吸烟患者除外[8]。所有入选的患者遵循自愿原则并签署知情同意书。本实验符合赫尔辛基原则，经我院伦理委员会批准。

1.1.2 实验药物  西红花苷由赣州市食品药品检验检测中心提供，批号为17304。配制西红花苷母液：称取药物粉末1 g，溶于10 mL PBS中，规格为0.22 μm滤器过滤除菌，获得浓度为10 mg/mL的母液，分装备用。

1.1.3 所需试剂  DMEM/F-12培养基、胎牛血清、含EDTA的胰酶等细胞培养用品均为Hyclone公司产品;CCK-8试剂盒、凋亡及周期检测试剂盒均来自上海贝博生物。

1.1.4 所用仪器  细胞培养箱（2046-II，美国），酶标仪（iMark，美国），流式细胞测定仪（FC500，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离培养及鉴定  子宫腺肌病灶组织收集后，立即置冰上，30 min内到超净台，参照文献[9]分离、纯化培养异位子宫内膜间质细胞，经消化、过滤、差速贴壁培养、免疫细胞化学鉴定为子宫内膜间质细胞。将（11.50±0.10）含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中，放于细胞培养箱中正常培养。后续取对数期生长的细胞用于功能实验。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖  0.25% EDTA-胰蛋白酶消化细胞，调整单细胞密度为1×103个/mL，接种于96孔板中，每孔200 μL，边缘孔用PBS填充，每个处理组做5个重复。放入细胞培养箱培养24 h。实验分为5组，各组加入药物西红花苷的终浓度为0、200、300、400、500 μg/mL。西红花苷0 μg/mL组为不加药物的正常对照组。设置5个复孔，分别在培养0、24、48、72、96 h的时间点取出，按检测试剂盒说明书操作，酶标仪上测定每孔OD值。实验重复三次。细胞增殖抑制率（%）=[1-（实验组OD值-空白对照组OD值）/（西红花苷0 μg/mL组OD值-空白对照组OD值）]×100%。

1.2.3 PI-AnnexinⅤ-FITC标记流式细胞法检测细胞凋亡  将指数期生长的细胞胰酶消化，离心，重悬后种于6孔板。在细胞铺满皿底90%左右时加入西红花苷溶液。实验分为5组，各组加入药物西红花苷的终浓度为0、200、300、400、500 μg/mL。48 h后，PBS洗涤，用不含EDTA胰酶消化细胞，离心，PBS洗涤2次后，按细胞凋亡检测试剂盒说明书操作处理，依次加入染液及缓冲液，混匀，避光孵育10 min后，流式细胞仪检测，CXP软件分析结果。

1.2.4 PI标记流式细胞法检测细胞周期  将指数期生长的细胞胰酶消化，离心，重悬后种于6 cm培养皿。在细胞铺满皿底80%左右时加入西红花苷溶液。实验分为5组，各组加入药物西红花苷的终浓度为0、200、300、400、500 μg/mL。48 h后，用0.25%的胰酶消化制成单细胞悬液，1000 r/min离心弃上清，1 mL PBS重悬细胞，再加10 μL Rase A，37°C水浴30 min后PBS洗涤2次，再加入50 μg/mL PI染色液500 μL，4°C下避光染色30 min后上机测试，采用周期分析软件分析细胞周期。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件，各组间采用one-way ANOVA 进行统计学分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异位子宫内膜间质细胞原代培养及鉴定

经消化、过滤、差速贴壁培养的子宫内膜细胞，光学显微镜下用鼠抗人vimenin抗体鉴定呈棕色，cytokeratine抗体鉴定不呈色为间质细胞，纯度达95%以上（封三图8）。

2.2 西红花苷对子宫内膜间质细胞增殖作用的影响

CCK-8检测结果显示西红花苷对子宫腺肌病异位子宫内膜间质细胞增殖有明显抑制作用，与药物浓度及时间呈正比，随着西红花苷浓度的升高和作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率也越高。从结果可以看到，浓度为400、500 μg/mL组处理细胞72 h后，增殖抑制率明显高于浓度为200 μg/mL组。见表1。

2.3 西红花苷诱导细胞凋亡

FITC-An-nexin V/PI双染色流式细胞术检测不同浓度西红花苷对细胞有不同程度的诱导凋亡作用，随着西红花苷浓度的增加，诱导细胞凋亡的作用越大。从结果可以看出，西红花苷浓度为200、300、400、500 μg/mL组分别处理细胞48 h后，细胞凋亡率依次为8.6%、20.7%、31.5%、40.9%，与西红花苷 0 μg/mL组（1.9%）相比有显著差异。见图1。

2.4 西红花苷对细胞周期影响

不同浓度的西红花苷作用子宫内膜间质细胞48 h后，PI染色检测细胞周期，结果显示：与对照组相比，随着药物浓度的升高，G0/G1期细胞所占比例逐渐增加，细胞周期被阻滞在G0/G1期。见图2。

3 讨论

子宫腺肌病虽是良性疾病，主要特征是子宫内膜在子宫肌层种植生长、浸润、反复出血。但具有侵袭性生长、远处转移等类似恶性肿瘤的生物学特性，临床上对子宫腺肌病的治疗目的在于缩减病灶，控制疼痛，促进生育，减少复发[10]，目前尚无有效的保守治疗方法。经确诊后多采用激素类药物或手术治疗，但激素治疗副作用大，停药后复发，而手术治疗多有一定的适应证，且保守性手术复发率都较高，常需切除子宮，创伤大，患者难以接受，二者均有一定的局限性。目前如何抑制子宫腺肌病灶的增长及转移是临床治疗的难点。子宫腺肌病发病机制仍不十分清楚，现多认为子宫腺肌病可能是一种多因素疾病，涉及相关学说很多，如经血逆流学说[11]、体腔上皮化生学说[12]，但单一的学说均不能完全解释清楚。子宫腺肌病的实质是具有生物活性的子宫内膜侵入肌层，因此内膜细胞的特殊的生物学功能可能是腺肌病发生的机制之一。异位内膜细胞粘附及侵袭能力增强[13，14]，增殖与凋亡异常[15，16]，免疫及相关炎症因素等可能参与子宫腺肌病的发生与发展[17，18]。

黄欧平课题组前期研究发现来自临床确诊的子宫内膜异位症患者异位子宫内膜组织中分离、鉴定的间质细胞中DNMT3A的mRNA与蛋白表达都显著下调;间质细胞中14-3-3ζ的mRNA及蛋白表达显著上调，进一步的MSP结果显示其基因启动子CpG岛存在去甲基化状态;经转染DNMT3A重组腺病毒表达载体、DNMT3A高水平表达的转基因细胞中细胞增殖率及迁移率减慢，细胞凋亡增加[8]，证明子宫内膜间质细胞异常至少是诱发子宫内膜异位症的主要原因之一，也很可能成为子宫内膜异位症治疗的新靶点。

西红花苷是从西红花植物中提取的活性化合物，其生物活性包括抗炎、抗氧化、抗抑郁和抗癌作用。体外多项研究显示西红花苷通过炎症及免疫信号通路发挥抗炎及抗肿瘤作用。西红花苷在诱导癌细胞凋亡、抑制其恶性增殖方面有显著的疗效。最近一项研究显示西红花通过miR-320/KLF5/HIF-1α信号传导抑制胃癌细胞的EMT，迁移和侵袭[19]。Rania RM等[20]研究数据表明西红花具有抗凋亡，抗炎和抗氧化活性，可能通过激活PI3K/Akt/mTOR轴和增强的miRNA-7和miRNA-221在鱼藤酮（ROT）诱导的大鼠的帕金森病中显示出有益的神经保护作用。本研究结果也表明，西红花苷可以抑制子宫腺肌病间质细胞的增殖，促进其凋亡，且药物浓度越高，效果越显著。

最新一项研究结果显示西红花通过降低炎症因子如TNF-α、PGE2、IL-1β和IL-6及其基因表达（TNF-α、COX-2、IL）的水平，对脂多糖诱导的败血症及其体外心脏毒性具有预防作用[21]。一项动物实验研究将西红花和美沙拉嗪单独和联合治疗溃疡性结肠炎的大鼠模型，西红花和美沙拉嗪通过抗氧化和抗炎作用对结肠组织产生保护作用[22]。在一项研究中发现西红花治疗急性胰腺炎，调节胰腺炎性细胞因子，上调Nrf-2的表达，并下调了IL-6、TNF-α、硝基酪氨酸和NF-κB的表达，显著降低胰腺水肿，血清淀粉酶和脂肪酶的水平[23]。免疫及炎症因素也参与了子宫腺肌病的发病进程，西红花苷是否能够参与调节间质细胞的免疫功能及炎症因子，从而对子宫腺肌病起治疗作用，非常值得进一步研究。

综上所述，本研究通过细胞功能实验发现西红花苷对子宫腺肌病中异位子宫内膜细胞增殖有明显抑制作用，与药物浓度及时间呈正比，药物浓度越高和作用时间越长抑制作用越明显。双染色流式细胞术检测发现西红花苷可诱导子宫内膜间质细胞凋亡，与药物浓度成正比。不同浓度的西红花苷作用子宫内膜间质细胞，细胞周期被阻滞在G0/G1期。实验结果表明西红花苷能抑制子宫腺肌病灶的生长及进展。但具体的分子生物机制还需要进一步研究。

[参考文献]

[1] Baldi A，Campioni M，Signorile PG.Endometriosis：Pathogenesis，diagnosis，therapy and association with cancer （review）[J].Oncol Rep，2008，19（4）：843-846.

[2] Farquhar C，Brosens I. Medical and surgical management of adenomyosis[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2006，20（4）：603-616.

[3] Singh SS，Suen MW.Surgery for endometriosis：Beyond medical therapies[J]. Fertil Steril，2017，107（3）：549-554.

[4] Fischer CP， Kayisili U，Taylor HS. HOXA10 expression is decreased in endometrium of women with adenomyosis [J].Fertil Steril， 2011，95（3）：1133-1136.

[5] 南京中醫药大学.中药大辞典[M].第2版.上海：上海科学技术出版社，2014：67.

[6] Wang Y，Liu S，Zhu H，et al.FRAT1 overexpression leads to aberrant activation of beta-catenin/TCF pathway in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Cancer，2008， 123（3）：561-568.

[7] Zlobec I，Lugli A，Baker K，et al. Role of APAF-1，E-cadherin and peritumoral lymphocytic infiltration in tumour budding in colorectal cancer[J].J Pathol，2007，212（3）：260-268.

[8] Zou Y，Liu FY，Wang LQ，et al. Downregulation of DNA methyltransferase 3 alpha promotes cell proliferation and invasion of ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis[J].Gene，2017，604：41-47.

[9] Wan Lei，Zou Yang，Wan Lihui，et al. Tanshinone IIA inhibits the proliferation，migration and invasion of ectopic endometrial stromal cells of adenomyosis via 14-3-3ζ downregulation[J].Archives of Gynecology and Obstetrics，2015，292（6）：1301-1309.

[10] Nassif J，Mattar S，Abu Musa A，et al.Endometriosis and cancer：What do we know？ [J] Minerva Ginecol，2013，65（2）：167-179.

[11] Sampson JA.Metastatic or embolic endometriosis，due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the venous circulation[J].Am J Pathol，1927，3（2）：93-110.

[12] 丰有吉，沈铿.妇产科学[M].北京：人民卫生出版社，2014：358-359.

[13] Chen N，DU B，Zhou H，et al.Abnormal expression of Nrf2 may play an important role in the pathogenesis and development of adenomyosis[J].PLoS One，2017，12（8）：e0182773.

[14] 郑德璇，段华，汪沙，等.局部粘着斑激酶和钙粘素E在子宫腺肌病子宫内膜中的表达与意义[J].中国计划生育和妇产科，2018，10（2）：27-31.

[15] Herndon CN，Aghajanova L，Balayan SA，et al.Global transcriptome abnormalities of the eutopic endometrium from women with adenomyosis[J].Reproductive Sciences，2016，23（10）：1289-1303.

[16] Wang Jing，Deng Xiaohui，Yang Yang，et al.Expression of GRIM-19 in adenomyosis and its possible role in pathogenesis[J].Fertility and Sterility，2016，105 （4）：1093-1101.

[17] Carrarelli P，Yen CF，Funghi L，et al.Expression of inflammatory and neurogenic mediators in adenomyosis：A pathogenetic role[J].Reproductive Sciences，2017，24（3）：369-375.

[18] Jiang C，Liu C，Guo J，et al.The expression of toll-like receptors in eutopic and ectopic endometrium and its implication in the inflammatory pathogenesis of adenomyosis[J].Scientific Reports，2017，7（1）：7365.

[19] Zhou Ying，Xu Qihua，Shang Jingjuan，et al.Crocin inhibits the migration， invasion，and epithelial-mesenchymal transition of gastric cancer cells via miR-320/KLF5/HIF-1α signaling[J].Journal of Cellular Physiology，2019， 234（10）：17876-17885.

[20] Salama RM，Abdel-Latif GA，Abbas SS，et al. Neuroprotective effect of crocin against rotenone-induced Parkinson's disease in rats：Interplay between PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and enhanced expression of miRNA-7 and miRNA-221[J].Neuropharmacology，2020，164：107900.

[21] Rahim VB，Khammar MT，Rakhshandeh H，et al. Crocin protects cardiomyocytes against LPS-Induced inflammation[J]. Pharmacol Rep，2019，71（6）：1228-1234.

[22] Faramarzpour A，Tehrani AA，Tamaddonfard E，et al. The effects of crocin， mesalazine and their combination in the acetic acid-induced colitis in rats[J]. Vet Res Forum，2019，10（3）：227-234.

[23] Godugu C，Pasari LP，Khurana A，et al. Crocin，an active constituent of Crocus sativus ameliorates cerulein induced pancreatic inflammation and oxidative stress[J]. Phytother Res，2019，25：6564.

（收稿日期：2020-03-02）