云南春燥环境对小鼠气道黏蛋白MUC5ac、纤毛蛋白DPCD及相关指标影响的研究

宋志敏 林银骥 魏宁颐 柏静萍 杨梅

摘要：目的 通过观察春燥环境中小鼠黏蛋白MUC5ac、纤毛动力蛋白DPCD等指标的变化，探讨该环境对小鼠气道“纤毛-黏液毯”的影响，并阐述 “燥伤肺津”“肺卫失宣”的原理。方法 复制云南春燥环境要素施予实验鼠，并以桑杏汤进行药物反证。结果 模型组MUC5ac较正常组显著减少（P<0.01），桑杏汤组MUC5ac较模型组显著增加（P<0.05）;各组实验鼠DPCD的含量由多至少依次：正常组>桑杏汤组>模型组。结论 云南春燥环境使小鼠MUC5ac、DPCD含量减少，治燥方药干预下有缓解，初步认为气道MUC5ac、DPCD作为春燥证模型的客观检测指标有待进一步研究。

关键词：春燥;以方测证;桑杏汤;黏蛋白MUC5ac;纤毛蛋白DPCP;脏器指数

中图分类号：R28 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）08-0063-04

【Abstract】Objective： To observe the changes of mucin MUC5ac and ciliary dynein DPCD in the spring dry environment to explore the effect of the environment on the “ciliary-mucus blanket” of mouse airway and to explain the principle of “dry lung injury” and “lung sluggishness”. Methods： The spring dry environmental elements in Yunnan were copied to apply to experimental mice， and Sangxing Decoction was used to disprove the drug. Results： MUC5ac in the model group was significantly reduced when compared with that in the normal group （P<0.01）， and MUC5ac in the Sangxing decoction group was significantly increased when compared with that in the model group （P<0.05）. The DPCD content of the experimental mice in each group was in the order of more to less： normal group>Sangxing decoction group>model group. Conclusion： The spring dry environment in Yunnan reduces the contents of MUC5ac and DPCD in mice， which can be relieved by the intervention of anti-dryness prescriptions. The MUC5ac and DPCD of the mouse airway is preliminarily believed as the objective detection indicators of the spring dryness syndrome model and need to be further studied.

【Key words】spring dryness， prescription to test the syndrome， Sangxing Decoction， mucin MUC5ac， fibrillin DPCP， organ index

燥淫證指外感燥邪，耗伤津液，以口鼻、咽喉、皮肤干燥为主要表现的证。多因气候干燥，或居处干旱少雨之地，感受外界燥邪所致。燥淫证的发生有明显的季节性和地域性。

《素问·五运行大论》认为“西方生燥”、“南方生火”，云南地处西南边陲，本应见温燥。但是，由于云南大部分地区具有四季温差小、昼夜温差大、春季干旱多风之气候特征。春季之风气与燥气相兼伤人则多发为风燥证。郑进教授将此燥证称为“云南春燥[1]”

目前“云南春燥”的实验研究已有一定前期基础，本实验研究拟在前期研究基础上，以病因学为指导，运用气候箱模拟云南春季“干燥多风”的气候特征，参考本地居民喜食辛辣香燥的饮食特点，将小鼠置于春燥环境中，通过观察小鼠各方面变化，分析云南春燥环境对小鼠模型的影响。以期阐释“燥胜则干”“燥伤肺津”、“肺卫失宣”等中医理论，为探索科学的、合理的、可重复的云南春燥证动物模型提供依据。具体研究如下：

1 实验材料

1.1 实验动物 30只SPF级KM小鼠，雄性（♂），重量：（20±2）g，供给方为昆明医科大学动物实验研究中心，生产许可号为SCXK（滇）K2015-0002。实验场所为云南中医药大学动物实验中心二楼。

1.2 实验药剂 桑杏汤：桑叶15 g，南沙参15 g，苦杏仁15 g，浙贝母15 g，栀子皮10 g，雪梨皮20 g，香豆豉10 g;此方源于《温病条辨》，药物剂量参考导师杨梅教授治疗春燥证的临床常用量。所用中药均由正规渠道购买。

中药汤剂制备，将药材用6倍水浸泡15 min，一煎先用武火煎沸，换文火继续煎15分钟，筛出药汁保存;二煎继以原药渣添4倍水，照前法煎10 min，滤渣取汁。将两煎药汁混匀加热，浓缩至所需浓度，置密封容器中放入4℃冰箱内保存。根据人体与小鼠体表面积换算法折算，灌胃小鼠所需要的给药体积为15 mL/kg。

1.3 实验仪器与试剂 DPCD多克隆抗体（美国Proteintech公司20936-I-AP）;MUC5ac ELISA试剂盒（美国R&D公司）;抗小鼠GAPDH抗体（美国CST公司 #5174）;PVDF膜（美国Millipore公司R6KA6693A）;BCA Protein Assay Kit、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（江苏碧云天公司P0010、P0015L）;SpectraMax i3X酶标仪（美国MD公司）;电泳仪、Trans-blot转达印槽组件、水平電泳槽（美国Bio-rad公司）;株磨式研磨器（美国Cole-parmer）;红外双色激光成像系统（美国LICOR公司）;人工动物培养箱RGX-250（上海印溪仪表仪器有限公司）;超声波加湿器（中山市哥尔电器有限公司）;离心机（国产湘仪CTK150R）;恒温水浴锅（江苏海门）。

2 实验方法

2.1 分组 将购入之昆明种雄性小鼠适应性观察培养3 d，随机将30只小鼠分为3组，每组10只。分别标记为正常组、模型组、桑杏汤组。

2.2 干预条件 3组小鼠分别置于人工气候培养箱内饲养。正常组全天段设置温度为（20±2）℃、湿度为（60±2）%，常规食料足量饲养，饮水不设上限，未施予干预因素。模型组、桑杏汤组2组根据云南当地近30年的气候记录（由气象局提供）及昼夜温差较大的特点，设置为：每天8∶00～20∶00温度（23±2）℃、20∶00～次日8点温度（13±3）℃，相对湿度（30±2）%，风速（3±0.5）m/s。饲喂订制辛燥食料，辛燥食料配比：98%正常食料+1.5%五香粉+0.5%辣椒粉，常规饮水。3组均每日8∶00～20∶00给予正常光照，垫料用玉米芯，1日1换。自实验第1 d开始，每日早上9 h，桑杏汤组小鼠予以药汁灌胃，其余2组不灌胃。各组小鼠饲养至第15 d取材，取材前8～12 h停止食、水供应。

2.3 生物表征 自实验开始，每日观察记录各组小鼠活动、情绪、被毛及饮食、饮水等情况。饮食、饮水量计算方法，将每组初始食量均设置为100 g/d，初始饮水设为200mL/d，具体如下：

10 g小鼠日食量=〔（100-次日剩存量）/小鼠总质量〕×10;

10 g小鼠日水量=〔（200-次日剩存量）/小鼠总质量〕×10，每天记录后，再将食料补充至100 g，用水补充至200mL。

2.4 取材

2.4.1 称取每只小鼠重量并备录标记，采用颈椎脱臼猝死小鼠，剥离多余组织暴露颈部气管，选取喉头向下距离0.5 cm处剪小口，气管插管，将37℃生理盐水徐徐注入肺组织1mL，再慢慢回吸，重复2次，集取肺泡灌洗液，采用离心（离心机设置为4℃，20 min，2500 r/min）处理，取上清液，获得样品标本，选择ELISA法检测黏蛋白MUC5ac。

2.4.2 剥离组织暴露颈部气管，裁取1.5cm气管冻存，采用免疫印迹法（WB）检测纤毛蛋白DPCD;完全裁开胸腔，暴露并剥取完整肺组织，用滤纸吸取多余液体，称肺重并记录。脏器指数（肺）=（肺重/体重）×1000 mg/g。

2.5 统计分析 选择SPSS 22.0进行数据处理，计算结果选用均数（x±s）来表达。各组间对比选取单因素方差分析法（One-Way ANOVA）计算数据结果。P<0.05体现为差别具备统计学意义。

3 结果

与正常组对比，模型组出现爪甲干枯、皮毛枯槁、尿少色黄、烦躁打斗等情况，且食量显著降低（P<0.05），饮水显著增加（P<0.01），肺脏器指数及MUC5ac含量均明显降低（P<0.01），差异具统计学意义;桑杏汤组皮毛爪甲无差别，初期有打斗后期趋于平和，食量、饮水量、肺脏器指数及MUC5ac含量有改变，但不具有统计学意义（P>0.05）。

与模型组对比，桑杏汤组皮毛爪甲光泽，食量增加（P<0.05），饮水量减少（P<0.05），肺脏器指数及MUC5ac含量均有明显提高（P<0.05），且具有统计学意义。详情见表1。DPCD含量检测由高至低递减为：正常组>桑杏汤组>模型组。见图1。

4 讨论

本实验通过观察云南春燥环境下，小鼠模型的生物表征、肺脏器指数、气道MUC5ac、DPCD指标、以及桑杏汤干预后的变化等情况，探讨云南春燥环境对小鼠模型的影响。

4.1 春燥环境对小鼠表征及脏器指数之影响 实验结果显示，模型组饮食量明显降低，饮水量显著增加，小便量少而黄，爪甲干枯，肺脏器指数降低，并见暴躁不安、焦虑打斗等现象。《素问玄机原病式》曰：“诸涩枯涸，干劲揭皴，皆属于燥。”说明燥伤津液，燥胜则干，小鼠津液损伤，故饮水自救则见饮水增加，尿源亏乏则见尿少;肺燥津伤，无以宣发津液于皮毛，皮毛失却润养，则见皮毛四末干枯无光泽;燥伤胃津，胃腑失润，受纳失司，则见食量减少。如张子和所云：“燥于外则皮肤皱揭，燥于中则精血枯涸，燥于上则咽鼻焦干[2]”。脏器指数能够反应机体某一内脏的损害水平[3-4]，肺喜润恶燥，燥邪侵入，首先犯肺，肺津枯槁，故肺脏器指数下降;春季木升肝旺，风、燥之邪兼夹而入，风胜则动，故小鼠在干燥表征的基础上又见暴躁不安、焦虑打斗等肝阳亢盛之行为。总之，上述现象，皆因风燥入侵，逢喜食辛燥之体，致使机体津伤液耗，肺络损伤，外伤内耗，上输外布无源所致。提示春燥环境对小鼠的宏观体征及部分内脏组织存在显著影响。前期研究中，始终将小鼠生物表征作为小鼠的证候表现来进行观察，其也是本实验拟定实验周期的主要依据之一。

4.2 春燥环境对小鼠气道MUC5ac、DPCD的影响现代研究认为，气道为气体交换的介质，气道黏液披覆在气道表层，纤毛浸润在其中，两者相辅构成“纤毛-黏液毯”[5]。“纤毛-黏液毯”具有保护和濡润上皮、吸附外界有害刺激物、防止病原菌异常繁殖等能力。其中，气道黏液是由水和细胞中黏蛋白共同组成的一类非均衡浓度的液胶。黏液的黏度和韧性是由黏蛋白的类型和含量决定[6]，黏蛋白MUC5ac是构成黏液的关键成分之一。MUC5ac变动提示气道黏液性状的改变[7]，能够反映黏蛋白的分泌程度[8]。纤毛蛋白DPCD是纤毛动力蛋白，在纤毛细胞中高表达。纤毛缺损相关蛋白会致使纤毛结构发生改变，出现气道黏液清除能力降低[9]。故“纤毛-黏液毯”的免疫功能有赖于黏液性状和纤毛动力学，两者任一改变都会产生明显影响[10]。本实验研究选取MUC5ac、DPCD作为判断“纤毛-黏液毯”功能的指标，以期从分子水平探究春燥环境对小鼠模型的影响。而“纤毛-黏液毯”的免疫功能与中医“肺卫宣发”功能有异曲同工之处。

本实验结果显示，模型组MUC5ac、DPCD含量明显低于正常组，提示黏膜黏液耗伤、纤毛运动受阻，“纤毛-黏液毯”抗邪功能下降。俞嘉言曰：“燥气先伤上焦华盖[11]”，即燥邪犯肺，肺燥津伤，卫气失宣，卫外功能下降。桑杏汤组MUC5ac、DPCD含量明顯高于模型组，则提示桑杏汤对于防止黏膜黏液耗伤、纤毛运动受阻有促进作用。桑杏汤是治疗燥证的经典方，具有疏散风邪，生津润燥功能。对于风燥证，用之则风邪得疏，燥邪得散，津液得生，干燥得润，肺能宣发，卫表得固，机体防御能力得以提升，故疗效明显。本实验运用桑杏汤旨在反证本实验之小鼠模型是否符合春燥证。

综上所述，本实验从宏观体征（生物表征）、组织结构（肺脏器指数）、分子水平（气道MUC5ac、DPCD）三个层面对春燥环境下的小鼠模型进行了初步探究。结果显示，小鼠出现明显干燥少津的表征，肺脏器指数下降，气道黏蛋白MUC5ac、纤毛蛋白DPCP显著变化，初步提示春燥环境对小鼠存在不同层面的损伤。同时阐释了中医“燥胜则干”、“肺燥津伤”、“肺卫失宣”之燥证机理。有鉴于此，笔者认为，本实验小鼠模型与云南春燥证契合度较大，气道MUC5ac、DPCD可作为春燥证模型的客观检测指标，有待进行全面、深入的探究。

参考文献：

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（收稿日期：2020-04-01）