临床标本分离的丝状真菌实验室检测与临床特点分析

曹敬荣 王育英 谢威 王岩 陈典典 李文军 刘云屹 闵嵘 王培昌

首都医科大学宣武医院检验科，北京100053

近年来，随着免疫功能低下人群增加，侵袭性真菌，尤其丝状真菌感染发病率逐年上升[1-3]，但由于真菌感染的临床表现非特异和实验室检测技术有限，侵袭性丝状真菌感染的诊疗面临较大挑战，患者预后差，病死率高[3-5]。尤其分离自呼吸道的丝状真菌是定植/污染抑或感染受到临床和实验室人员的特别关注和重视。因此，本研究分析总结了首都医科大学宣武医院临床分离的丝状真菌患者实验室检测结果和临床资料，以期为实验室鉴定及临床明确诊断、治疗侵袭性丝状真菌感染提供科学依据，报道如下。

1 对象与方法

1.1 感染标准 侵袭性真菌感染诊断标准参照我国《侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则》[6]和2016 《年美国感染病学会曲霉病诊断处理实践指南》[7]，诊断分为确诊、临床诊断和拟诊。本研究诊断符合率以临床诊断和确诊病例进行分析，无菌体液中真菌培养阳性时需结合临床排除标本污染。

1.2 临床资料和菌株来源 回顾性分析2016年1月至2019年1月首都医科大学宣武医院各科室送检标本分离出丝状真菌患者的临床资料和实验室结果。每例患者多次分离相同菌株者只计入首次分离菌。本研究为回顾性分析，研究符合《赫尔辛基宣言》的原则，该研究过程不会对人体发生任何接触，不会对治疗措施有改变。不会对患者本身产生风险，知情同意被放弃。研究中所有个人信息都在数据库中加密，患者数据被去除标识，无侵犯隐私。

1.3 方法

1.3.1 分组与纳入标准 根据丝状真菌感染的诊断标准分为肺部感染组和定植/污染组，收集所有入选患者的临床资料进行回顾性分析，包括年龄，性别，合并疾病 (如糖尿病、肺部疾病等)，糖皮质激素，广谱抗生素使用情况，抗真菌治疗情况和预后等。同时分析丝状真菌感染患者中死亡组与存活组的不同。

1.3.2 菌种分离培养及鉴定 将临床送检的呼吸道分泌物标本直接接种于沙保弱平板;组织标本研磨成匀浆后接种于沙保弱平板，置28℃孵箱培养;血培养标本报警阳性后涂片镜检同时转种沙保弱平板，置28℃和35℃培养，观察生长菌落形态、颜色等特点，乳酸酚棉蓝染色观察菌丝、孢子和分生孢子形态、生长方式和颜色等，初步鉴定丝状真菌菌属，并经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(德国布鲁克公司)鉴定丝状真菌种属。

1.3.3 G 试验和GM 试验检测 试验严格按照G试验和GM 试验试剂盒说明书操作。G 试验 [丹娜(天津)生物科技股份公司]通过吸光度速率法测定真菌1,3-β葡聚糖含量，cut-off值＜37.5为阴性，＞90为阳性。GM 试验(美国Bio-Rad公司)，采用双抗体夹心法检测血清或肺泡灌洗液中的半乳甘露聚糖含量，血清判定折点为≥0.5为阳性，肺泡灌洗液判定折点为≥1.0为阳性[8]。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。患者的年龄等为计量资料且呈正态分布，以±s 表示，2组间的比较采用成组设计资料的t检验;构成比、检出率等为计数资料，统计分析采用配对资料χ2检验、Fisher确切概率检验或非参数检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般临床资料 共收集分离出丝状真菌患者110例，男70例，女40例;年龄 (69.81±13.93)岁，年龄范围为26～97 岁，≥60 岁占82.73%。确诊丝状真菌感染者70例，培养阳性与感染诊断符合率为63.64%，其中62例(56.36%)为肺部感染组;8例为耳道感染、角膜感染、伤口感染和血流感染;定植/污染组40 例 (36.36%)。肺部感染组患者年龄(70.03±12.41)岁，与定植/污染组患者年龄[(71.32±15.31)岁]相比，差异无统计学意义 (t=1.69，P =0.10)。肺部感染患者中≥60岁者51例 (82.26%)，感染病例主要集中于呼吸科、急诊科和老年科。定植/污染组患者≥60岁者35例 (87.5%)，丝状真菌主要分离自急诊科、老年科和呼吸科。肺部感染组患者肺部疾病或双肺受累、糖皮质激素使用及合并糖尿病者显著多于定植/污染组(P 值均＜0.05)。2组患者在年龄、性别、临床表现和影像学表现方面差异均无统计学意义(P 值均＞0.05)，肺部感染组发热患者多于定植/污染组 (χ2=10.736，P =0.001)。见表1。

2.2 丝状真菌分布 临床分离出丝状真菌的标本主要来源于呼吸道 (92.73%，102/110)，其中痰液90例(81.82%)、肺泡灌洗液12例(10.91%);分离自眼角膜、耳道、伤口和血液分别为2.73%、1.82%、1.82%和0.91%。痰液中检出菌种多为曲霉菌属 (85.29%)，其中烟曲霉59.80%、黄曲霉12.75%，另外分离到构巢曲霉、土曲霉、杂色曲霉和聚多曲霉等少见曲霉。耳道分泌物主要检出菌种为曲霉菌属，黑曲霉多见。角膜分泌物检出丝状真菌有链格孢菌属、镰刀霉和曲霉菌属。伤口分泌物检出毛孢子菌属和接合菌属。血液检出1例层生镰刀菌。肺部感染组和定植/污染组的菌种构成均以曲霉菌为主，差异无统计学意义 (χ2=0.410，P ＞0.05)，见表1。

2.3 肺部感染组患者预后分析 62例肺部丝状真菌感染者中死亡22 例 (35.48%)，存活40 例(64.52%)。死亡组与存活组患者的性别比较差异无统计学意义 (χ2=0.01，P ＞0.05)，但死亡组患者年龄显著高于存活组[(78.86±10.14)岁比(65.18±10.84)岁，t=4.83，P=0.01]。死亡组使用糖皮质激素者显著多于存活组(χ2=8.40，P ＜0.05)。但2组患者合并肺部疾病或肺受累、糖尿病及使用广谱抗菌药物方面比较，差异均无统计学意义(P 值均＞0.05)。见表2。

2.4 G 试验和GM 试验结果 102例肺部分离出丝状真菌患者均进行了G 试验和GM 试验检测，其中G 试验阳性56例 (54.90%)，GM 试验阳性54例(52.94%)。肺部感染组G 试验结果阳性54例(87.10%)，定植/污染组G 试验阳性2 例(5.00%);肺部感染组中GM 试验结果阳性52例(83.87%)，定 植/污 染 组GM 试 验 阳 性2 例(5.00%)。肺曲霉感染患者血清中GM 含量显著高于定植/污染患者(χ2=60.71，P =0.01)。

3 讨论

近年来，由于人口老龄化增多，及糖皮质激素、广谱抗菌药物和免疫抑制剂在临床的广泛应用，丝状真菌感染的发病率有明显的上升趋势[1-4]，已成为危重症患者和免疫功能低下人群的主要死因之一。曲霉菌是条件致病性真菌，普遍存在于空气和自然界中，曲霉菌孢子可通过呼吸道吸入肺部定植或导致侵袭性曲霉菌感染。不同部位感染侵袭性丝状真菌种类不同[9-10]，临床表现和预后亦不同。角膜分泌物和耳道分泌物临床表现特殊，分泌物涂片多数可直接发现菌丝，诊断容易，通过抗真菌治疗可较快取得疗效。而呼吸道标本丝状真菌分离阳性需要结合宿主因素、临床特点等综合分析，免疫功能正常或低危宿主多为定植，而严重免疫缺陷者则会感染致病。

本研究中丝状真菌分离最多为曲霉菌，占总分离数的81.82% (90/110)。其中烟曲霉占曲霉菌总数的90%，仍为主要的分离菌。但其它少见曲霉(如构巢曲霉、土曲霉、杂色曲霉和聚多曲霉等)比例有所上升，与文献报道烟曲霉是侵袭性曲霉病最常见的病原体一致[11-13]。本研究分离到的其它丝状真菌包括镰刀菌、青霉菌、赛多孢菌和接合菌等，可导致不同部位感染，对常用抗真菌药物不敏感或耐药，值得临床重视。曲霉菌属是肺部感染和定植最常见的丝状真菌，分布科室以呼吸科、急诊科、老年科等为主，此类科室多为年龄偏大、合并多种基础疾病、免疫力相对低下患者，易吸入环境中曲霉孢子定植或感染有关。

表1 肺部感染组与定植/污染患者临床资料与微生物学特点分析 [例 (%)]

表2 62例肺部感染丝状真菌患者预后分析 [例 (%)]

结构完整的气道可有效防御曲霉菌定植，而肺部疾病患者气道结构破坏，可增加曲霉菌的定植和感染。有文献显示既往有COPD 和支气管扩张症等结构破坏的呼吸道疾病是导致肺部丝状真菌感染的重要危险因素[14-15]。本研究对肺部感染组和定植/污染组比较，合并肺部疾病或肺受累、使用糖皮质激素及糖尿病的感染患者丝状真菌分离率显著高于定植组 (P 值均＜0.05)，与报道一致[10];而2组性别、年龄、肾功能不全等比较，差异均无统计学意义(P 值均＞0.05)。死亡组与存活组相比，年龄和糖皮质激素使用是导致死亡的主要危险因素，与文献报道一致，提示临床老年患者由于免疫力低下、基础状况差，易发生感染丝状真菌且死亡风险大，应用糖皮质激素会抑制巨噬细胞和单核细胞对曲霉孢子和菌丝的免疫[5，12]。因此，临床对糖皮质激素的使用要严格把握指征，避免滥用导致呼吸道真菌的定植、感染甚至死亡风险的增加。

本研究显示，肺部感染组和定植/污染组患者临床表现均有咳嗽、咳痰等不典型表现，2组影像学检查均不特异，表明早期丝状真菌感染诊断和治疗困难。58.06%肺部感染组患者有发热症状，显著高于定植/污染组 (P ＜0.05)。提示临床一旦出现发热，需结合影像学、临床其它表现等警惕是否由定植演变为侵袭性感染的可能，及时送检痰或肺泡灌洗液镜检和培养，并监测G 试验和GM 试验，以便及早诊断和及时抗真菌治疗。本研究中尽管诊断为肺部丝状真菌感染患者均使用了抗真菌药物治疗，但病死率仍高达35.48%，显著高于定植/污染组(P ＜0.05)，提示临床一旦拟诊应及早应用药物及其他治疗手段，减少延迟诊治带来的不良预后。

目前大多实验室鉴定丝状真菌最广泛的方法仍为传统的形态学鉴定方法[2，13，15]，但该方法依赖菌落生长时间和判读者的经验，且对相似菌种无法鉴定到种。近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱通过检测真菌中特异性蛋白可快速、准确鉴定丝状真菌。它正逐步应用于丝状真菌的诊断和菌种分类[16]，能把常见的曲霉菌、镰刀菌等准确鉴定到种复合体水平，但受限于数据库信息有限及丝状真菌不同生长阶段特点 (菌丝大小、产孢情况等)和不同前处理提取蛋白方法。2016年美国感染病协会曲霉诊疗指南更新中，GM 检测在诊断肺曲霉菌病中被强烈推荐，作为证据级别高的诊断方法[7]。目前已有报道GM、IgG/Ig A 等对肺部侵袭性曲霉菌感染有较好的诊断价值[18-19]。本研究对所有肺部分离丝状真菌的患者均进行了G 试验和GM 试验检测，结果显示在丝状真菌肺部感染患者中G 试验和GM 试验的阳性检出率显著高于定植/污染患者，尤其对于肺曲霉感染者，其血清中GM含量显著高于定植/污染者 (χ2=60.71，P =0.01)，提示临床联合使用G 试验和GM 试验可提高曲霉菌的检出率，对提示感染抑或定植/污染有重要意义。但G 试验和GM 试验不能确定丝状真菌种类，且受影响因素多，临床上应动态监测减少假阳性率。

综上所述，临床分离培养出丝状真菌后，一定要结合宿主因素，患者临床表现，影像学检查，相关的血清学检查(G 试验、GM 试验)和病原学检测。尤其来源于非无菌部位分离的丝状真菌，应排除污染或定植。对可疑感染患者应及时多次送检高质量合格标本，提高丝状真菌的阳性检出率，以尽快明确诊断提高临床治疗的精确性，防止病情进展。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突