线粒体糖尿病患者三例及其家系的临床及基因检测分析

张娜娜，黄有烨，王祺，章秋，胡红琳*

线粒体糖尿病（mitochondrial diabetes mellitus，MDM）是一组因线粒体基因（mitochondrial DNA，mtDNA）缺陷导致组织能量代谢障碍所引起的异质性疾病，因其遗传特点表现为严格的母系遗传且多伴有神经性耳聋，故又称为母系遗传糖尿病伴耳聋（maternally inherited diabetes and deafness，MIDD）。因早期临床表现不典型，多数MDM患者表现类似于2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM），少数患者因发病年龄较小而常被诊断为1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM），因此MDM常容易误诊，不能得到规范诊治且影响患者预后的判断。已报道的与MDM发生相关的mtDNA突变位点达几十种，其中最常见的是线粒体tRNA Leu（UUR）3243A→G点突变，约占85%［1］。本研究对3例临床疑诊为MDM的患者行线粒体疾病基因检测，并根据检测结果及相关文献报道指导患者治疗。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2017—2019年在安徽医科大学第一附属医院及六安市人民医院内分泌科疑诊为MDM的3例患者，均为女性，发病年龄17～27岁。将3例先证者及其7名家系成员纳入研究，并行mtDNA测序。本研究已通过安徽医科大学第一附属医院伦理委员会审批，研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法 本研究基于现有资料，采用真实世界研究方法收集研究对象临床资料，按照标准方法测量身高、体质量、腰围、臀围，并以体质量（以kg为单位）除以身高（以m为单位）的平方计算体质指数（body mass index，BMI）、以腰围（以cm为单位）除以臀围（以cm为单位）计算腰臀比（waistto-hip ratio，WHR）。隔夜空腹8 h后抽取研究对象肘静脉血10 ml用于检测糖化血红蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）、糖尿病相关抗体及进行基因测序，同时先证者及明确糖尿病诊断者行馒头餐试验，未确诊者行口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT），分别于0、30、120 min抽取其肘静脉血3 ml。采用全自动生化分析仪（HITACHI 7170S Japan）测定血糖（blood glucose，BG），采用化学发光法（ChemiLuminescence）测定C肽（C peptide，CP），采用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，BIO-RAD）测定HbA1c，采用免疫印迹法（Western blotting，SIEMENS）测定糖尿病相关抗体。采用血液基因组柱式中量提取试剂盒（天根）提取基因组DNA，用Qubit 2.0型荧光计及0.8%琼脂糖凝胶电泳对DNA样本进行质检，通过Illumina公司NovaSeq 6000系列测序仪进行高通量测序（PE150），目标序列测序覆盖度不低于99%。线粒体3243位点的测序或mtDNA的测序由北京智因东方转化医学研究中心完成。

2 结果

2.1 先证者一般资料 3例先证者一般资料见表1。

2.2 先证者临床特点 患者1，女，34岁，27岁诊断为糖尿病，29岁出现听力减退。目前使用胰岛素治疗。母亲、姨娘、哥哥有糖尿病病史，父母非近亲结婚。BMI 18.3 kg/m2，WHR 0.86。馒头餐结果示0、30、120 min BG分别为12.06、16.26、25.14 mmol/L，CP 分别为0.39、0.47、0.85 μg/L。HbA1c为10.1%。糖尿病相关抗体阴性。该家系4代共15人，其中接受调查的共6人〔Ⅱ-2，Ⅱ-4，Ⅱ-5，Ⅲ-1，Ⅲ-3（患者1），Ⅳ-2〕，其余亲属拒绝接受调查（见图1）。

患者2，女，27岁，26岁诊断为糖尿病，27岁出现听力减退。目前使用胰岛素治疗。家族史不详。BMI 14.8 kg/m2，WHR 0.81。馒头餐结果示0、30、120 min BG分别为5.10、7.97、22.78 mmol/L，CP分 别 为 0.18、0.30、1.53 μg/L。HbA1c为13.8%。糖尿病相关抗体阴性。患者2自幼被领养，故未分析家系成员。

患者3，女，19岁，18岁诊断为糖尿病，暂无听力减退。目前使用胰岛素治疗。母亲、两个姨娘、妹妹有糖尿病病史，父母非近亲结婚。BMI 14.4 kg/m2，WHR 0.80。馒头餐结果示0、30、120 min BG分别为4.27、5.25、11.21 mmol/L，CP分别为0.36、0.60、2.85 μg/L。HbA1c为5.3%。糖尿病相关抗体阴性。该家系3代共11人，其中接受调查的共3人〔Ⅱ-4，Ⅲ-1（患者3），Ⅲ-2〕，仅患者3接受基因检测，其余亲属拒绝接受调查（见图2）。

2.3 先证者1家系成员一般资料及生化指标 先证者1家系成员一般资料及生化指标见表2、3。

2.4 先证者3家系成员一般资料及生化指标 先证者3家系成员一般资料及生化指标见表4、5。

2.5 基因测序结果 对先证者及其家系成员共8人进行基因测序，共6人存在tRNA 3243A→G点突变，分别为家系1中先证者1、Ⅱ-4、Ⅲ-1、Ⅳ-2及先证者2、先证者3。先证者1及其家系成员基因测序结果见图3。

表1 3例先证者一般资料Table 1 General information of 3 cases of proband

图1 先证者1家系图Figure 1 Family chart of proband 1

图2 先证者3家系图Figure 2 Family chart of proband 3

3 讨论

线粒体是除细胞核外唯一携带遗传物质的细胞器，而mtDNA由37个基因组成，包含2个rRNA基因、13个多肽编码基因和22个tRNA基因。因mtDNA缺少组蛋白保护及有效的自我修复机制，故易发生基因突变，在糖尿病患者中mtDNA的突变率约为1.5%，其中又以tRNA Leu（UUR）3243A→G点突变最为常见［2］，而在有糖尿病家族史、发病年龄早（≤45岁）、非肥胖体型、使用胰岛素治疗的人群中突变率增至2.5%～11.1%［3-4］。1992年，VAN DEN OUWELAND等［5］报道了首例mtDNA tRNA 3243A→G突变引起的MDM的家系。1995年，项坤三等［6］首次在我国报道了tRNA 3243A→G点突变引起的MDM。自此研究者们开始重视对MDM的研究。

表2 先证者1家系成员一般资料Table 2 General information of the family members of proband 1

表3 先证者1家系成员生化指标Table 3 Biochemical parameters of the family members of proband 1

表4 先证者3家系成员一般资料Table 4 General information of the family members of proband 3

图3 先证者1及其家系成员基因测序结果Figure 3 Pedigree gene sequence of proband 1 and her family members

表5 先证者3家系成员生化指标Table 5 Biochemical parameters of the family members of proband 3

本研究3例患者发病年龄较低，均为非肥胖体型，均存在胰岛β细胞功能障碍，胰岛素相关抗体检测均阴性，患者1、患者2早期即出现听力减退。研究发现，MDM患者易出现听力障碍，且男性听力受损程度更重，进展更快［7］。耳蜗是MDM患者听力受损的主要部位，OLMOS等［8］研究发现，tRNA Leu（UUR）3243A→G突变可使内耳血管边缘细胞腺苷三磷酸减少，并致使柯蒂氏器外毛细胞放大声波所需能量较少，故而导致听力受损。RAUT等［9］通过植入人工耳蜗治愈了MDM患者的听力障碍，也侧面印证了损伤部位在耳蜗。本研究3例先证者由于发病年龄较低（＜30岁）且体型偏瘦、血糖控制较差，血清空腹CP水平低而一直诊断为T1DM，但经仔细询问病史及伴随症状、认真体检后发现其早期即表现为听力减退，且第一例先证者有明确家族史、家系成员亦伴听力障碍而拟诊为MDM，再进一步完善基因检测后明确3例患者均携带tRNA 3243突变基因。先证者1有明显的母系遗传特点，先证者1兄妹两人及其母亲均为糖尿病患者，父亲无糖尿病病史；对该家系中共6人行基因检测，共发现4人携带tRNA 3243突变基因，其中3例已表现为糖尿病，2例伴有听力减退，先证者1女儿（Ⅳ-2）携带tRNA 3243突变基因但暂未表现为糖尿病及无听力下降，因其母亲（Ⅲ-3）亦携带tRNA 3243突变基因，因此需定期监测其血糖及听力，以早期做出诊断。先证者3亦有明显的母系遗传特点，先证者3姐妹两人、母亲及两个姨娘均为糖尿病患者，发病年龄均约为20岁，其母亲及姨娘均伴有听力减退。虽先证者3及其妹妹暂未表现为听力减退，但因先证者3检出tRNA 3243突变基因，故需定期监测先证者3姐妹两人的听力。

因MDM的主要发病机制为胰岛β细胞分泌胰岛素障碍，且mtDNA突变会加重β细胞凋亡［10］，故MDM一经确诊，应早期予以胰岛素治疗。对于药物治疗，虽然二甲双胍为糖尿病的首选及一线用药，但因其会抑制线粒体的氧化还原作用，加重乳酸酸中毒风险，故MDM患者不宜使用［11］；此外，NINOMIYA等［12］研究表明，吡格列酮在MDM患者中也有一定作用，其原因可能与提高血浆脂联素水平从而改善脂肪组织功能障碍相关，这为MDM患者的药物治疗提供了另一个方向。另外，一些改善线粒体能量代谢的药物也可以作为MDM的辅助用药，包括辅酶Q10［13］、硫辛酸［14］等，但是基因治疗才是根本治疗。TACHIBANA等［15］已成功通过基因移植在猴子模型中成功进行了基因治疗，而TONIN等［16］设计的特殊的RNA分子导入培养人体细胞的线粒体后成功降低了DNA突变率，提示了基因治疗将来可能用于治疗MDM，但目前尚未应用于临床，仍需进一步探索。

综上所述，对于发病年龄低、非肥胖体型、胰岛β细胞功能障碍、母系遗传、伴有听力下降的糖尿病患者需提高警惕，应仔细询问其伴随症状及家族史，考虑MDM的可能，必要时完善听力专科检测，并尽早完善基因检测，以便及时确诊，规范治疗。tRNA 3243A→G点突变的MDM常表现为听力障碍，而对于确诊的MDM患者应早期予以胰岛素治疗，避免使用双胍类药物，基因治疗有望成为未来治疗MDM的重要手段。应尽量动员MDM先证者家系成员筛查血糖、听力，必要时完善基因检测，以便早期诊断，改善预后，同时期待产前诊断和治疗技术的发展，从而通过早期干预而最终改善其结局。

作者贡献：胡红琳、章秋、王祺进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析；张娜娜、黄有烨进行数据收集及整理；张娜娜进行统计学处理，结果的分析与解释，撰写论文；胡红琳进行论文的修订，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。