miR-363通过PDZD2对骨肉瘤细胞调控的分子机制研究

何帆 江武 丁国明 范小良 朱六龙

骨肉瘤的发病率约占原发恶性骨肿瘤的15%～23%［1］，是儿童和青少年癌症死亡的主要原因。miR-363在多种类型的癌症中表现出肿瘤抑制作用，而其在骨肉瘤中的抑制功能还需要进一步研究。PDZD2是促进胰岛瘤细胞增殖的多PDZ结构域蛋白，研究发现其在前列腺癌（AIPC）中被激活，是一种6-PDZ结构的蛋白［2］。PDZD2在骨肉瘤发生中的作用目前仍不清楚。2016年12月至2019年3月作者通过实验研究，分析miR-363和PDZD2在骨肉瘤细胞MG-63中的功能及其相互作用，探讨miR-363对骨肉瘤细胞的调控作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 骨肉瘤细胞株（MG-63，HOS和Saos2）和正常人成骨细胞株（hFOB1.19）均购自中国科学院上海细胞所。骨肉瘤细胞株用加入10%胎牛血清（FBS；美国Thermo Fisher Scientific公司）的DMEM培养基（美国HyClone公司），37℃和5%CO2浓度条件下培养。hFOB 1.19细胞用DMEM/Ham's F12培养基（DMEM/F12；1：1w/w混合物）在34℃，5%CO2浓度条件下培养。GAPDH抗体，E-钙黏着蛋白抗体，增殖细胞核抗原（PCNA）抗体，caspase-3抗体和波形蛋白抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；PDZD2抗体购自美国Abcam公司。miR-363模拟 物（5'-AAUUGCACGGUAUCCAUCU GUA-3'） 和阴 性 对 照（5'-UUCUCCGAACGUGU CACGUTT-3'）寡核苷酸序列购自上海吉玛制药技术有限公司。靶向 PDZD2（siRNA-PDZD2）的小干扰RNA（siRNA）（139，5'-GCUGAACUUUGCUGUGGGGAUU-3'；580，5'-CUCUG AACCAGGAGAAACAUU-3'； 和 1027，5'-GCUGGGAAUUCAGGUUAGUUU-3'），pcDNA 3.1-NEAT1和阴性对照购自广州RiboBio 公司。PDZD2的psiCHECK2-UTR（野生型和突变型）由上海吉玛制药技术有限公司提供。

1.2 RNA分离和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR） 根据标准RNA分离方案，使用TRIzol试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司）从组织或细胞系中提取总RNA。用于qPCR的反应条件如下：95℃，60sec；然 后95℃，5s进 行40循 环；然后60℃，34s。通过在ABI 7500快速序列检测系统（美国Thermo Fisher Scientific公司）上使用SYBR Premix Ex Taq（大连Takara生物技术有限公司）对miR-363和PDZD2水平进行定量。将miR-363和PDZD2的水平分别标准化为U6和GAPDH的水平。引物分别为：miR-363，正向5'-ACACTCCA GCTGGGAATTGCACGGTATCCATC-3'和 反 向5'-CT CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAC AGATG-3'；U6，正向 5'-CTCG CTTCGGCAGCACA-3'和 反 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；PDZD2，正 向5'-TCTGTACTGTGTACCTCACCAA-3'和 反向 5'-CCCTGCGCTTTTCACCATAG-3'；GAPDH，正 向5'-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3'和 反 向5'-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'。使用公式 2-△△Ct（21）计算mRNA表达的相对倍数变化。

1.3 蛋白质印迹分析（Western blot） 用RIPA细胞裂解缓冲液（美国Santa Cruz Biotechnology公司）提取组织或细胞系中的总蛋白，并用BCA分析试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）确定这些蛋白的浓度。每组蛋白质样品（30µg）通过15%SDS-PAGE电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上（美国GE Healthcare），5%脱脂牛奶在室温下封闭1h，用含0.1%Tween-20（TBST）的一抗，4℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤，与二抗在室温下孵育1h。最后，用ECL-Plus试剂（美国Millipore）观察印迹。实验用GAPDH作为对照。

1.4 免疫荧光试验 采用免疫荧光试验测定肿瘤细胞中E-钙粘蛋白，波形蛋白和PDZD2的水平。用含4%多聚甲醛的PBS液固定细胞。将细胞在-20℃下用100%甲醇渗透10分钟，用含3%牛血清白蛋白（BSA）的PBS液封闭60min，然后加入一抗，4℃，孵育过夜（抗PDZD2为美国Abcam公司产品，抗E-钙粘蛋白为美国Cell Signaling Technology公司产品，抗波形蛋白为美国Cell Signaling Technology公司产品）。PBS冲洗，并置于盖玻片上，与偶联有荧光染料的二抗在室温下于黑暗中孵育1h。用DAPI染色细胞核后，中性树胶固定，并在FV10i共聚焦显微镜（日本Olympus Corporation）下观察细胞。

1.5 免疫组化 采用免疫组化测定PDZD2在肿瘤中的表达。把切片在二甲苯中孵育5min，依次用100%和95%乙醇孵育10min，进行抗原暴露，然后在室温下用3%过氧化氢将载玻片封闭30min。将切片与抗PDZD2的一抗在4℃孵育过夜，然后再接种抗二抗。使用EnVision检测系统试剂盒（丹麦达格）评估免疫染色结果。

1.6 细胞转染 接种MG-63细胞，用PBS洗涤细胞，分别用 miR-363 mimics（50nM），siRNA-PDZD2（1µg/ml）和相应的阴性对照（NC）转染24、48和72h。转染方法参照100 nM Lipofectamine 2000转染试剂说明书（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.7 CCK-8实验检测细胞活性 取转染成功的MG-63细胞，按每1ml完全培养基加入10µl CCK-8将二者混合均匀后，每孔加入10µl CCK-8液，孵育1h，用酶标仪在450nm处测量吸光度。CCK-8试剂盒为日本Dojindo Molecular echnologies公司产品。

1.8 克隆形成能力检测 取转染后的单细胞悬液进行计数，将细胞悬液的细胞密度调整为1×103/ml；在培养板中分3种浓度接种细胞：分别接种50个细胞/孔、100个细胞/孔、200个细胞/孔；接种完毕后，所有孔中均补加培养基至液体量300µl/孔；在37℃、5%CO2条件下培养2～3周；定时观察，当培养皿中出现肉眼可见的细胞克隆时，即终止培养。去除上清液，加4%多聚甲醛液固定细胞20min。用结晶紫染料进行细胞染色。染色成功后洗去未附着的染色液，细胞培养板置于空气中自然晾干；最后拍照，计算细胞集落数。

1.9 细胞凋亡和细胞周期分析 Hoechst 33258检测细胞凋亡：取转染后的MG-63细胞，用4%低聚甲醛固定，将固定的细胞用0.1µg/ml的Hoechst 33258溶液（德国Sigma-Aldrich公司）染色，并在荧光显微镜（日本Olympus公司）下观察核形态的变化，荧光的激发波长设定为460nm。流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期：流式细胞仪为美国BD公司产品。将2µl膜联蛋白V与2µl碘化丙啶（PI）（美国Thermo Fisher Scientific公司）混合，每流式管加入1×105个细胞，避光孵育30min，上机检测。TUNEL分析：将肿瘤组织用福尔马林固定，石蜡包埋，4µm切片，使用细胞凋亡原位检测试剂盒（日本和光纯药工业株式会社），按说明书对肿瘤切片进行染色。随机选择每个切片的五个非重叠视野，并在荧光显微镜下观察。为确定细胞周期的相位分布，将细胞用PI染色液（10µg/ml RNase A；50µg/ml PI）在37℃下避光染色30min，然后使用流式细胞仪进行分析。

1.10 细胞侵袭能力检测 Transwell小室试验：将转染后的MG-63细胞加入到含0.2%BSA的无血清培养基中，调整培养基中细胞的密度为2×105个/ml。取调整好的细胞悬液，加入到Transwell小室上孔中，每孔内接种2×104个细胞；然后再向Transwell小室的下室中加入含有10%FBS血清的完全培养基，每室加入700µl培养基。加注完成后将Transwell小室放入到二氧化碳细胞培养箱中，箱内条件为：5%CO2、37℃。培养48h后取出小室，将小室洗净后，用结晶紫染色液进行染色。将小室用中性树脂封片。在OLYMPUS CX41正置显微镜下观察小室与拍照，观察时每个小室选取4个视野进行测量，用IPP软件进行细胞计数。每个实验重复3遍。

1.11 动物模型试验 将30只雄性小鼠（4～5周；20～22g；购自天津赛尔生物技术有限公司）置于25℃的无菌室中，进行12h的明/暗循环，并在室温下灭菌，可自由进食、进水。准备已转染miR-363mimics、miR-363（NC）和对照组人MG-63单细胞悬液，调整细胞浓度至1×107个/ml，每只裸鼠后胁腹部皮下注射50µl细胞混悬液（每组10只小鼠）。从第2周起测量肿瘤的大小，1次/隔3d，计算肿瘤体积：V（cm3）=宽度2（cm2）×长度（cm）/2。

1.12 统计学方法 PCR实验数据按照2-△△Ct方法处理数据［3］。采用SPSS 19.0统计学软件。计量资料以（±s）表示，两组或多组间比较用t检验、单向方差分析或双向方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外细胞试验证实过表达miR-363可抑制骨肉瘤细胞的生长 发现miR-363在骨肉瘤细胞株中呈现低表达状态，其中MG-63细胞的miR-363低表达与其他骨肉瘤细胞相比较显著。Hoechst染色表明，过表达miR-363的MG-63细胞具有较高的凋亡率（见图1）。流式细胞仪结果表明miR-363过表达可以诱导MG-63细胞中的G1/S阻滞（见图2）。

图1 Hoechst33258染色显示miR-363过表达组细胞凋亡增多

图2 流式细胞仪检测显示miR-363过表达组细胞中处于G1期的细胞数量增加，处于S期的细胞数量显著减少

2.2 过表达miR-363可以调节上皮-间质转化（EMT）表型，从而抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力 Transwell小室试验表明，miR-363过表达后，MG-63细胞的侵袭能力受到抑制（见图3）。免疫荧光和蛋白质印迹分析结果显示，miR-363过表达后，上皮标记E-钙粘着蛋白的表达被上调，而间质标记波形蛋白（Vimentin）被下调，细胞增殖标志物PCNA的表达降低，而caspase-3的裂解增加。

图3 miR-363过表达组细胞侵袭能力减弱

2.3 PDZD2是miR-363的直接靶标且可以在体外促进骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖 本研究利用在线预测软件miRWalk 寻找miR-363的潜在靶标，最后发现PDZD2为其靶基因。进一步分析发现PDZD2 mRNA的3'非翻译区（UTR）具有miR-363的结合位点；因此，在骨肉瘤细胞中研究PDZD2与miR-363的相互作用。结果表明，MG-63细胞中miR-363的过表达显著抑制其产生PDZD2 mRNA和蛋白的能力（见图4）。为确认PDZD2是miR363的直接靶标，将具有PDZD2全长3'UTR（野生型或突变型）的萤光素酶报道载体转染到MG-63细胞中，用双萤光素酶试验分析，结果发现，miR-363 mimics削弱野生型PDZD2 3'UTR的萤光素酶活性，但未影响对照组的突变型PDZD2 3'UTR，表明miR-363直接靶向骨肉瘤细胞中的PDZD2，以降低PDZD2蛋白水平（见图5）。

图4 免疫荧光检测MG-63细胞中PDZD2的表达

图5 用全长3'UTR转染MG-63细胞（野生型和突变型）PDZD2，并使用萤光素酶报告基因法测定

2.4 骨肉瘤细胞中PDZD2蛋白水平降低的影响 在通过siRNA有效敲低MG-63细胞中PDZD2的表达后，测定细胞的凋亡，克隆形成能力和侵袭能力。结果表明，敲低PDZD2可以诱导细胞凋亡并减弱细胞的集落形成和侵袭能力。

2.5 miR-363通过下调体内PDZD2水平限制肿瘤生长 结果表明，注射过表达miR-363的MG-63细胞的小鼠发展出明显较小的肿瘤，显示出生长延迟（见图6）。对肿瘤组织mRNA和蛋白质水平的检测证实miR-363上调和PDZD2下调；通过检测肿瘤细胞的凋亡率证明miR-363在体内显著诱导骨肉瘤细胞的凋亡（见图7）。这些调节作用与PCNA表达降低，caspase-3裂解增加及EMT表型受损有关（见图8）。

图6 miR-363 mimics组的裸鼠体内肿瘤生长速度较慢

图7 TUNEL染色估算肿瘤切片中的细胞凋亡率（×200）

3 讨论

骨肉瘤是一种间叶组织来源的恶性肿瘤。虽然对骨肉瘤形成过程中miRNA的致癌和抑癌功能已有相关文献报道，但miRNA调控的靶基因等分子机制仍待研究。本研究通过体外和体内试验发现，肿瘤抑制因子miR-363在骨肉瘤细胞中被下调并通过直接靶向PDZD2促进肿瘤生长。PDZD2最初被认为是一种癌基因，其表达在前列腺肿瘤细胞系和人原发性前列腺肿瘤中上调。本研究表明PDZD2表达与骨肉瘤进展有关。一项与肾细胞癌相关的单核苷酸多态性的最新研究表明，PDZD2的rs10054504与中国人群肾细胞癌的风险显着相关［4］。本研究显示，PDZD2的抑制促进骨肉瘤细胞的凋亡，并抑制骨肉瘤细胞系的迁移和侵袭能力。此外，PDZD2的敲低显著降低细胞增殖标志物PCNA的表达，诱导caspase-3的裂解，并损害骨肉瘤细胞中的EMT表型。与miR-363/PDZD2相关的下游信号及其在骨肉瘤细胞中的功能有待进一步研究。

肿瘤发生期间miRNA的失调是恶性转化的标志。抑癌基因miR-363属于miR-92a家族，是一组高度保守的miRNA，包括miR-25，miR-92a-1，miR-92a-2和 miR-363［5］。已有研究显示，miR-363-3p在具有淋巴结转移的结直肠癌（CRC）组织标本中被下调，从而通过增加体内和体外SRY-box 4（Sox4）的表达促进CRC细胞的迁移、侵袭并诱导EMT［6］。在前列腺癌中，PC-3细胞中高水平的miR-363通过靶向抑制MYC原癌基因来促进细胞增殖，诱导细胞转化并促进EMT［7］。目前研究表明，骨肉瘤细胞中的miR-363水平被下调，进而导致其靶基因PDZD2的表达上调。在骨肉瘤细胞中恢复miR-363表达会损害细胞活力，集落形成，迁移和侵袭，同时通过PDZD2诱导凋亡和细胞周期停滞。这些影响可能与PCNA，caspase-3和EMT表型的降低有关。同样，Wang等［8］研究认为，miR-363通过靶向SOX4抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。表明，miR-363可以在多种类型的癌症中充当通用的肿瘤抑制因子。总之，PDZD2作为骨肉瘤细胞中抑癌基因miR-363的新靶标；miR-363的过表达或PDZD2的抑制可促进caspase-3相关肿瘤细胞凋亡，抑制EMT，并诱导骨肉瘤消退。