丹酚酸A对高脂饮食引起的NAFLD小鼠肠道菌群异常的研究

赖尚磊 冯璐燕 丁秦超 陈欢 李松涛 窦晓兵*

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的，肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，近年来，NAFLD的发病率逐年升高，据估计全球一般人群的患病率约为20%～30%，在肥胖或糖尿病人群中高达70%～90%［1-2］。肠道微生物目前被公认为NAFLD发病的关键因素，肝脏和肠道有密切的解剖和功能关系，肠道菌群的相关代谢产物可以通过肝门静脉进入肝脏，从而影响肝脏代谢，并且目前已发现在NAFLD老鼠模型和患者中，其肠道菌群的结构发生了显著的变化［3-4］，因此肠道菌群已成为治疗NAFLD疾病的新靶点。近年研究表明，中药在治疗疾病的同时调整了肠道菌群的结构［5］，这可能是中药发挥治疗作用的机制之一。中药丹参作为“活血化瘀”药一直被中医作为治疗NAFLD的首选，丹酚酸A（Salvianolicacid A，SAA）是丹参主要成分之一，已有研究发现SAA可减轻高脂饮食（High fat diet，HFD）诱导的NAFLD［6］，而其改善NAFLD的机制尚未完全明确。本研究旨在探讨SAA对HFD诱导的小鼠肝脏脂质沉积及损伤的作用机制及其对肠道菌群的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 18只清洁级C57BL/6 雄性小鼠，8周龄，体重（25.0±0.5）g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（浙）2008-0037。

1.2 试剂和仪器 （1）试剂：SAA 购于成都曼思特生物科技有限公司（批号：MUST-17022805），高脂饲料购于美国New Brunswick 公司（批号：D12492），果糖购于美国Acros Organics 公司（批号：C16135），蔗糖购于美国 Sigma-Aldrich 公司（批号：S7903），生理盐水购于上海振誉生物科技有限公司（批号：CZ0036），谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、游离脂肪酸（Free fatty acids FFA）、组织样本甘油三酯（Triglycerides，TG）测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所（批号 ：C009-2，A042-2，F005-2）。（2）仪器：MR-4100酶标仪购于美国Dynatech公司，全自动样品快速研磨仪购于上海净信上海净信实业发展有限公司，-80℃立式超低温冰箱购于美国Thermo公司，Allegra™ 64R低温高速离心机购于美国Beckman公司，手掌式离心机，型号LX-100，购自海门其林贝尔仪器制造有限公司，移液枪购于德国Eppendorf公司。

1.3 NAFLD小鼠模型构建 18只C57BL/6 雄性小鼠饲养于浙江中医药大学实验动物中心SPF环境中，动物喂养在标准饲养笼里，饲养温度为（22±2）℃，湿度为60%，光照12h/12h昼夜循环。所有小鼠适应1周后随机分为3组：正常对照（Ctrl）组（n=6）、高脂模型（HF）组（n=6）、高脂+丹酚酸A腹腔注射（HF+SAA）组（n=6）。Ctrl组采用普通饲料喂养，HF组及HF+SAA组采用HFD喂养：采用含60%脂肪的高脂饲料和含高果糖和高蔗糖的饮用水喂养，其中果糖含量为55%，蔗糖含量为45%，混合饮用水中共含有42g/L的碳水化合物，所有动物自由饮食及取水。Ctrl组和HF组注射生理盐水，HF+SAA组注射丹酚酸A 40mg/（kg·d），共喂养10周。造模结束后，小鼠禁食6h后，用10%水合氯醛麻醉，下腔静脉取血，并收集小鼠组织样本及粪便样本，存放于-80℃立式超低温冰箱。

1.4 检测指标 （1）血清生化指标检测：造模结束后，用10%的水合氯醛将小鼠麻醉，采用下腔静脉取血，将血浆放在冰块上静置30min后，用4℃离心机（3000 r/min）离心15min，取上清液。用ALT和TG试剂盒测得血清的ALT和TG含量。（2）肝脏生化指标检测：从-80℃冰箱取出肝脏组织后，置于全自动样品快速研磨仪研磨，研磨完全后用4℃离心机（12000 r/min）离心15min，取上清液。用组织样本甘油酶法测定试剂盒测得三组肝脏TG含量。

1.5 肠道微生物菌群的测定 采集小鼠粪便样本，装入1.5ml无菌离心管，采用低温运输（0℃）送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。利用Illumina Miseq™高通量测序技术获得小鼠粪便中16s rDNA V4区序列，并基于RDP数据库对比分析Ctrl、HF和HF+SAA三组中每只小鼠粪便中细菌的种类和丰度。

1.6 统计学方法 采用 SPSS 22.0统计软件。对于各项连续型资料，先进行正态性检验，如果每组均满足正态分布且两组间方差齐，采用t检验进行组间比较；所有检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 丹酚酸A对高脂喂养小鼠的体重及能量摄入的影响 HF+SAA组采用40mg/（kg·d）剂量的丹酚酸A对HF组的小鼠进行注射，结果显示，丹酚酸A的注射不会影响小鼠日常食物的摄入量；与Ctrl组比较，HF组小鼠的体重明显上升（P＜0.05），而HF+SAA组小鼠的体重相较于HF组明显有下降（P＜0.05）。见表1和图1。

表1 各组小鼠体重变化趋势（±s）

表1 各组小鼠体重变化趋势（±s）

注：与Ctrl组比较，*P＜0.05；与HF组比较，#P＜0.05

Ctrl组 HF组 HF+SAA组初始体重（g） 24.5±1.0 23.9±1.6 25.0±2.3最终体重（g） 31.6±2.2 44.1±3.5* 39.8±3.3#体重增加量（g） 7.0±1.5 20.2±2.4* 14.0±1.7#食物摄入量（g/d） 3.03±0.26 2.49±0.21 2.5±0.2

图1 各组小鼠每周体重变化趋势

2.2 丹酚酸A改善高脂饲料喂养的小鼠肝损伤 Ctrl组小鼠肝脏颜色鲜红，边缘锐利，而HF组的肝脏体积略增大，包膜紧张光滑，边缘变钝，颜色发黄，HF+SAA组小鼠的肝脏相较于HF组，颜色更鲜红，边缘较锐利（见图2A）。Ctrl组小鼠肝脏组织细胞排列紧密，细胞核大而圆，且居中。HF组小鼠肝脏细胞排列疏松，且细胞间出现脂滴。HF+SAA组小鼠与HF组比较肝脏细胞排列较紧密，脂滴明显减少，细胞状态接近于对照组（见图2B）。

图2 小鼠肝脏及肝脏HE染色图

2.3 血清和肝脏中的生化指标 HF组小鼠肝脏中的TG含量明显高于Ctrl组，而HF+SAA组小鼠肝脏中TG含量明显低于HF组。HF组小鼠血清中的ALT、FFA和TG含量明显高于Ctrl组（P＜0.05），HF+SAA组小鼠血清中的ALT、FFA和TG含量明显低于HF组（P＜0.05）。见图3。

图3 血清和肝脏中的生化指标

2.4 丹酚酸A对HFD小鼠肠道菌群的影响 根据16s rDNA测序结果显示，在HFD喂养引起的NAFLD患者中，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）仍是优势菌，但不同的研究中，其亲和丰度和属检测有差异。而在本研究中，与Ctrl组比较，HF组Firmicutes明显上调，Proteobacteria和Bacteroidetes显著下调。HF+SAA组与HF组比较，Firmicutes有下降趋势，Proteobacteria和Bacteroidetes显著上调（见图4）。

图4 每组小鼠中各个菌群的分布情况

3 讨论

本研究发现，SAA能有效减轻由HFD引起的小鼠体重增加，并显著改善HFD喂养小鼠肝脏的损伤及脂质沉积，此外，SAA能显著调控肠道菌群的结构失衡，提示肠道菌群可能参与SAA保护HFD诱导的NAFLD。

NAFLD已成为全球最常见的肝脏疾病，其通常与肥胖、胰岛素抵抗和代谢综合征的发生密切相关。HFD诱导的肝脂肪变性模型被广泛用于NAFLD的预防和治疗的研究中，本资料结果显示，HFD喂养10周后小鼠出现了严重的脂肪变性和肥胖，证明了NAFLD小鼠模型的成功建立，SAA是丹参主要成分之一，具有许多潜在的药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗纤维化和抗炎［7-11］，Ding等［12］研究结果首次证明SAA通过TXNIP/NLRP 3和TXNIP/ChREBP通路改善HFD诱导的肝脏脂质积累和炎症；王润平等［13］发现，SAA能减缓HFD诱导的LDH、SOD的升高从而减轻NAFLD。在本研究同样证实了SAA对HFD诱导的NAFLD的保护作用，SAA能够降低HFD诱导的血浆中ALT、FFA和TG的增加，同时减轻了肝脏的脂质沉积。这些结果均显示SAA能有效阻止肝脏的脂肪变性。

人类肠道微生物群包含10～100万亿微生物，且肠道中的细菌数量显著超过人体细胞总数［14］。已有研究表明，肠道和肝脏有多种相关的相互依赖性，肠-肝轴与NAFLD的进展密切相关［15］。且有证据表明与无疾病的患者比较，NAFLD患者的肠道通透性显著增加，NAFLD疾病与肠道菌群的变化显著相关［16］。长期HFD改变了肠道菌群及肠道屏障功能，其将会引起肥胖及肥胖相关性脂肪肝疾病［17-18］。肠道菌群在NAFLD发病机制中的参与是复杂和多因素的［19-20］，目前为止，大多数研究均集中在微生物群的菌群结构组成上，菌群中最常见的是Bacteroidetes和Firmicutes，而在NAFLD患者中，Bacteroidetes 和 Firmicutes仍然占主导地位，Mouzaki等［21］研究发现，HFD喂养后，在无菌小鼠体中接种Firmicutes组比接种Bacteroidetes组的体重、肝脏重量和肝脏脂肪显著增加，Chen等［22］研究发现，NAFLD患者肠道菌群中Proteobacteria更丰富，其可能促进肠道对脂质的摄取。在本研究结果中同样证实这个现象，HFD组中Firmicutes和 Bacteroidetes比例显著高于对照组，而Proteobacteria表达丰度高于对照组。SAA干预组能显著逆转这类菌群结构，降低了Firmicutes和 Bacteroidetes的菌群比例，并降低了Proteobacteria的丰度，预示SAA可能通过调控菌群的结构从而影响NAFLD的进展。

综上所述，本研究发现SAA可能通过改善HFD诱导的NAFLD小鼠肠道菌群的结构紊乱，进而减轻NAFLD的病理现象，表明SAA对NAFLD的发生发展具有显著的抑制作用，结果提示SAA可作为防治NALFD的潜在药物，为临床采用SAA治疗 NAFLD 提供理论参考。