显脉金花茶叶片中山奈酚的提取分离及含量测定

陈秋虹 刘鹏 韦英亮 刘布鸣 黄艳 莫建光

摘要：利用溶剂提取法对显脉金花茶（Camellia euphlebia Merr.ex Sealy）干燥叶乙酸乙酯部位提取分离，并测定其含量。结果表明，从显脉金花茶叶片中乙酸乙酯部位首次分离得到化合物山奈酚（kaempferol）;建立了HPLC法对显脉金花茶叶中山奈酚的含量测定方法，山奈酚含量在0.10～0.40 μg/mL范围内线性关系良好，平均回收率为99.84%（RSD=1.59%），山奈酚含量为0.318 2～0.364 0 mg/g。

关键词：显脉金花茶（Camellia euphlebia Merr.ex Sealy）;山奈酚;含量测定

中图分类号：R284.1;R282.71           文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）14-0156-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.14.032 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Solvent extraction method was used to extract and separate the ethyl acetate part of dried leaves of Camellia euphlebia Merr.ex Sealy， and determine its content. The results showed that the compound kaempferol was first isolated from the ethyl acetate part of Camellia euphlebia Merr.ex Sealy; the content determination method of kaempferol in Camellia euphlebia Merr.ex Sealy was established by HPLC. The kaempferol ranged from 0.10 to 0.40 μg/mL. The internal linear relationship was good， the average recovery rate was 99.84% （RSD=1.59%）， and the measured content of kaempferol was 0.318 2～0.364 0 mg/g.

Key words： Camellia euphlebia Merr. ex Sealy;kaempferol;content determination

金花茶（Camellia nitidissima C. W. Chi）是山茶科山茶属金花茶组金花茶系植物[2]，因其具有清热解毒、利尿利湿、止痢止血等功效而被广泛应用[1-3]。大量的临床试验证明，金花茶具有降血糖、降血压、降血脂[4-6]、降血清中胆固醇、抑制肿瘤生长[7，8]、防止动脉粥样硬化、激活人体多种酶、提高肌体免疫能力、延缓衰老抗氧化等作用[9-11]。目前，广西壮族自治区防城港市建立了世界惟一的国家级野生金花茶自然保护区，并建立起了该物种基因库，防城港市金花茶组植物主要类型有普通金花茶（Camellia nitidissima）、东兴金花茶（C.tunghinensis）、显脉金花茶（C. euphlebia Merr.ex Sealy）及长柱金花茶（C. nitidissima var. longistyla）。

有关金花茶化学成分研究尚处于初步阶段，而显脉金花茶作为其中一个品种在分析测定方法中尚未有文献进行研究报道，本研究通过采用现代溶剂提取分离和各种柱色谱方法、波谱技术（UV、TLC、IR、1H-NMR、13C-NMR）等方法首次分离鉴定显脉金花茶叶片中活性成分——山奈酚，并建立了HPLC法测定显脉金花茶叶片中山奈酚含量的方法，该法操作简便可行、结果准确、重复性好，可作为显脉金花茶叶片中山奈酚的含量测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 显脉金花茶干燥叶，采集于广西壮族自治区防城港市，经广西中医药研究院中药研究所赖茂祥研究员鉴定为显脉金花茶（Camellia euphlebia Merr.ex Sealy）。

1.1.2 仪器 Thermo TSQ QUANTUM ACCESS液相色谱/质谱联用仪（美国Thermo公司）;CAMAG TLC SCANNER薄层色谱扫描仪（瑞士卡玛公司）;RE-52A型旋转蒸发仪（上海雅荣生化仪器厂）;LC-10AT型高效液相色谱仪配SPD-10A型紫外检测器（日本SHIMADZU公司）;YRT-3型熔点仪（天津市天大天发科技有限公司）;UV 2550 型紫外分光光度計（日本岛津公司）;METTLER-XS205 分析天平（瑞士METTLER公司）;SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）;HH-S恒温水浴锅（江苏金坛市医疗仪器厂）;KQ5200B型超声波仪（160 W、40 kHz，江苏昆山市超声仪器有限公司），各种不同规格口径的普通玻璃层析柱。

1.1.3 试剂 柱层析硅胶（100～200目）、薄层层系硅胶（硅胶G）（青岛海洋化工厂）;乙腈（色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司）;浓硫酸、冰醋酸、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、丙酮、磷酸、甲醇（均为中国医药集团上海化学试剂公司，分析纯），乙醇为工业纯;水为超净水。

山奈酚对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用），纯度>98%。

1.2 方法

1.2.1 化学成分的提取与分离 取晒干显脉金花茶叶片10 kg，用95%乙醇溶液加热回流3 h，提取2次。合并提取液，减压回收溶剂，浓缩液再水浴挥干至无醇味，干燥后得到无水乙醇总浸膏。

取出显脉金花茶叶片总浸膏加水混悬，依次用石油醚（沸程60～90 ℃）、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩后，不同步骤萃取后得到产物各122.0、46.0、18.0、79.0 g。取经乙酸乙酯萃取后的产物18.0 g经硅胶柱色谱（360.0 g，200～300目）分离，石油醚-乙酸乙酯（100∶0→100∶1→80∶1→50∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→0∶100）梯度洗脱，在石油醚-乙酸乙酯（5∶1，V/V）得到粗粉末，以氯仿-甲醇-冰醋酸（75∶15∶1，V/V）为洗脱剂反复硅胶柱层析，得到化合物Ⅰ（14 mg）。

1.2.2 化合物Ⅰ的结构鉴定 化合物Ⅰ：黄色针状结晶，熔点276～278 ℃，溶于氯仿、甲醇、乙酸乙酯、丙酮，不溶于石油醚、水。365 nm处紫外光下显黄绿色荧光，有拖尾现象，加酸后，该现象消失，喷三氯化铝溶液荧光增强显黄绿色单斑。其碳谱数据（表1）与文献[12]报道的山奈酚基本一致，因此化合物Ⅰ确定为山奈酚（kaempferol）。

1.2.3 化合物Ⅰ——山奈酚的定量分析

1）对照品溶液的制備。精密称定山奈酚对照品10 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，制得每1 mL含1 mg的山奈酚储备溶液，取   1 mL山奈酚对照品储备液，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1 mL含有山奈酚100 μg的山奈酚对照品溶液。

2）供试品溶液的制备。精密称定显脉金花茶叶干燥粉末1.0 g，加入甲醇-25%盐酸（4∶1）混合溶液25 mL，称定重量，加热回流100 min，放冷，再称定重量，用甲醇补重，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

3）色谱条件的确定。色谱柱为Ultimate XB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）;流动相为乙腈∶0.2%磷酸水溶液=32∶68;流速为1.0 mL/min;检测波长为360 nm;柱温为室温;进样量为20 μL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

精密量取100 μg/mL的山奈酚对照品0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50 mL至10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液补足至刻度，摇匀，配成系列浓度的对照品溶液，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，以山奈酚含量为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为y=76 568.6x-23 137.9，r=0.999 7，表明山奈酚含量在0.10～0.40 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2 精密度考察

分别精密吸取20 μL对照品溶液及供试品溶液进行试验，连续进样6次，测定峰面积积分值，RSD分别为1.61%、1.69%，表明精密度良好。

2.3 稳定性考察

精密称取显脉金花茶干叶粉末1.0 g，制备供试品溶液后进行试验，12 h内每间隔2 h进样，山奈酚峰面积RSD为1.72%。结果表明，供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.4 重复性考察

精密称取显脉金花茶干燥叶粉末1.0 g，制备6份供试品溶液进行试验测定。结果表明，山奈酚平均含量为0.381 mg/g，RSD为2.27%。

2.5 回收率考察

精密称定6份已知山奈酚含量的显脉金花茶干燥叶粉末0.5 g，置于平底烧瓶中，加入1.8 mL 100 μg/mL的山奈酚，制备供试品溶液。结果表明，山奈酚平均回收率为99.84%，RSD为1.59%（表2）。

2.6 样品测定结果

精密称取3批次显脉金花茶干燥粉末各1.0 g，制备供试品溶液后进行试验，测定山奈酚的含量，结果见表3。

3 小结

本研究采用现代分离方法对显脉金花茶叶片乙酸乙酯部位的化学成分进行分离，首次从该品种植物中分离鉴定得到山奈酚。山奈酚属于黄酮醇类化合物，黄酮类成分有良好的抗氧化、抗肿瘤等药理活性。以山奈酚对照品作为对照，建立了显脉金花茶干燥叶中测定山奈酚含量的HPLC法，并测定了3批样品中的含量，测定结果准确、灵敏度高、重现性好，适用于显脉金花茶的质量控制，为其多指标质量评价研究提供了科学依据。

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