鞣花酸柔性纳米脂质体的制备工艺优化与体外透皮实验

林琪, 张嘉颖, 吴振, 陈燕江, 王立强

(1. 华侨大学 生物医学学院，福建 泉州 362021; 2. 厦门大学 药学院，福建 厦门 361102; 3. 晏容美业集团有限公司，福建 厦门 361012)

鞣花酸(EA)是一类天然多酚二内酯，是没食子酸的二聚衍生物，存在于多种水果、坚果、蔬菜和中药材中.研究表明，鞣花酸具有多种药理活性，包括抗氧化[1-2]、抗炎[3-5]、抗病毒、抗肿瘤[6]、抗纤维化[7]和化学预防[8]等作用，除此之外，鞣花酸还具有美白清除自由基、抗皱等活性[9]，因此，被广泛地应用于护肤品中[10].然而，水溶性差、溶液稳定性差[11]、透皮渗透性差[12]等缺点使鞣花酸的应用受到了限制，这些缺点亟待解决.

角质层是皮肤的最外层，是透皮吸收需要克服的最重要的屏障[13].目前，促进透皮吸收的方法有磁导入、电致孔、微针和纳米药物载体等[14-15].近年来，纳米药物载药已成为极具前景的透皮给药方式.柔性纳米脂质体(FNL)是第二代脂质体，由磷脂和膜柔软剂(如胆酸钠、去氧胆酸钠、吐温-80、吐温-20等)组成，结构与生物膜相似.柔性纳米脂质体是一种多功能的靶向药物载体，与传统脂质体相比，其具有高度变形性，可促进药物进入皮肤表皮层和真皮层，将大部分的药物留在皮肤中，减少进入人体血液循环的药物量，在表皮和真皮形成药物库，形成缓释模型，使药物在局部持久治疗[16-17].柔性纳米脂质体的透皮递送机制一般认为是以水合梯度为驱动力，借助自身的变形能力，穿过比自己粒径小得多的皮肤孔道，进入表皮层或真皮层[18-19].本文运用Box-Behnken效应面法进行处方优化，利用FNL技术对EA进行药学修饰，提高EA的皮肤渗透率及药物稳定性.

1 实验部分

1.1 实验仪器

1200型高效液相色谱仪(图像二极管阵列(DAD)检测器，美国安捷伦公司)；紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；电子天平(德国赛多利斯科学仪器有限公司)；恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)；磁力加热搅拌器(江苏省金坛市友联仪器研究所)；NanoBrookomi型多角度纳米粒度与高灵敏度Zeta电位分析仪(美国布鲁克海文仪器公司)；JEM-1200EX型透射电子显微镜(日本电子株式会社)；旋转蒸发仪、超声波清洗仪(河南省巩义市予华仪器有限责任公司)；RYJ-6B型药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器有限公司).

1.2 实验材料

SD大鼠(雄性大鼠，体质量约200 g，购自福建医科大学实验动物中心)；PC-98T型蛋黄卵磷脂(上海市艾伟拓医药科技有限公司)、鞣花酸(质量分数为98%，上海市源叶生物科技有限公司)、胆固醇(质量分数≥95%，上海Adamas-beta公司)、甲醇(色谱级，广东省汕头市西陇化工股份有限公司)，其余试剂均为市售分析纯.

2 实验方法与结果分析

2.1 鞣花酸的体外分析方法

2.1.1 紫外吸收波长的测定 以甲醇作为空白对照，对质量浓度为10 μg·mL-1的鞣花酸溶液进行200～400 nm波长范围内的全波长扫描，记录扫描图谱，最大吸收波长为255 nm.

2.1.2 高效液相色谱的条件 色谱柱为Sino Chrom ODS-BP(4.6 mm×150.0 mm，5 μm)； 流动相为甲醇-磷酸溶液(V(甲醇)∶V(磷酸)=55∶45，磷酸的体积分数为0.1%)；检测波长为255 nm；流速为1 mL·min-1；进样量为30 μL.

2.1.3 系统适应性实验 取溶剂甲醇溶液(空白溶剂)、鞣花酸甲醇溶液(5 μg·mL-1，鞣花酸对照品)及鞣花酸柔性纳米脂质体(EA-FNL)进样分析，其高效液相色谱(HPLC)图谱，如图1～3所示.图1～3中：S为电信号；t为色谱柱流出物的流出时间.

图1 空白溶剂的HPLC图谱 图2 鞣花酸对照品的HPLC图谱 Fig.1 HPLC chromatograms of blank solvent Fig.2 HPLC chromatograms of ellagic acid reference

图3 EA-FNL的HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatograms of EA-FNL

2.1.4 标准曲线的制备 精密称取10.0 mg鞣花酸，用甲醇溶液溶解并定容于100 mL，配制成0.1 mg·mL-1的鞣花酸对照品储备母液.稀释母液，得到质量浓度分别为1,2,3,4,5,6,8,10,30 μg·mL-1的系列对照品溶液，并进样分析.测定鞣花酸的峰面积，作为纵坐标(y)，以鞣花酸质量浓度为横坐标(x)进行线性回归，得到线性回归方程y=331.79x-186.34，相关系数R2=0.999 1，线性范围为1～30 μg·mL-1.

2.1.5 精密度实验 制备质量浓度为5 μg·mL-1的鞣花酸供试品溶液，并进样分析，连续进样6 次，测定保留时间与峰面积，其相对标准偏差(RSD，n=6)分别为0.19%，0.17%，精密度良好.

2.1.6 重复性实验 平行配制6份质量浓度为5 μg·mL-1的鞣花酸供试品溶液，并进样分析，测定其峰面积，RSD为1.64%(n=6)，重复性良好.

2.1.7 回收率实验 精密量取1.0 mL空白脂质体混悬液置于10 mL容量瓶中，加入适量鞣花酸样品储备液，配置成质量浓度分别为3，5，10 μg·mL-1的低、中、高3组回收率供试品溶液，每组平行配置3份，分别用甲醇定容至刻度，混匀、过滤，并进样分析，根据回归方程计算出质量浓度，结果表明，回收率为98.75%～102.34%，RSD为0.95%.

2.1.8 日内稳定性实验 制备质量浓度为5 μg·mL-1的鞣花酸供试品溶液，分别于0，2，4，8，12 h进样分析，无其他杂质产生，RSD为1.87%(n=5)，供试品溶液的日内稳定性良好.

2.1.9 日间稳定性实验 配制质量浓度为5 μg·mL-1的鞣花酸供试品溶液，分别于0，1，2，3 d进样分析，无其他杂质产生，RSD为0.91%(n=4)，供试品溶液的日间精密度良好.

2.2 EA-FNL的制备与包封率的计算

2.2.1 EA-FNL的制备 取处方量的卵磷脂、胆固醇、鞣花酸置于茄形瓶内，用10 mL甲醇与三氯甲烷(体积比为4∶1)超声1 min溶解，于25 ℃下旋蒸30 min，除掉有机溶剂，直至瓶壁上形成薄膜，真空干燥箱2 h，除去残余有机溶剂，加40 mL磷酸缓冲液(pH=7.0)，水化2 h，过0.22 μm针式滤膜，振摇混匀，即得EA-FNL，于4 ℃下保存备用.

2.2.2 包封率的计算 取制备好的1 mL EA-FNL置于10 mL容量瓶，加入甲醇破乳定容，超声15 min后，过0.45 μm滤膜，测定鞣花酸总质量浓度(ρt).另取1 mL EA-FNL置于30 ku的超滤离心管，于4 000 r·m-1下离心20 min，取滤过液置于10 mL容量瓶，甲醇定容，超声15 min后，过0.45 μm滤膜，测定鞣花酸质量浓度(ρy).

EA-FNL包封率(δE)的计算公式为

2.3 EA-FNL制备的影响因素考察

通过单因素实验来考察表面活性剂的种类、卵磷脂与表面活性剂的质量比、卵磷脂与胆固醇的质量比、药物质量浓度、水化时间对包封率和粒径(φ)的影响，再通过Box-Behnken 响应面法优化预测最佳处方.5种单因素对EA-FNL包封率和粒径的影响,如图4所示.

(a) 表面活性剂的种类

(b) 卵磷脂与表面活性剂的质量比 (c) 卵磷脂与胆固醇的质量比

(d) 药物质量浓度 (e) 水化时间 图4 5种单因素对EA-FNL包封率和粒径的影响Fig.4 Effects of five single factors on EA-FNL encapsulation efficiency and particle size

2.3.1 表面活性剂的种类 固定鞣花酸质量浓度为25 μg·mL-1，水化时间为3 h，卵磷脂与表面活性剂质量比为4∶1，卵磷脂与胆固醇的质量比为4∶1，设定表面活性剂种类分别为吐温-80、胆酸钠、吐温-20，按照节2.2.1方法制备脂质体，测定其包封率及粒径，结果如图4(a)所示.由图4(a)可知：使用吐温-20制备脂质体的质量最佳，包封率最大，粒径最小.这可能是由于吐温-20具有丰富的亲水基团，使水化过程更加容易.

2.3.2 卵磷脂与表面活性剂的质量比 固定鞣花酸的质量浓度为25 μg·mL-1，水化时间为3 h，表面活性剂为吐温-20，卵磷脂与胆固醇的质量比为4∶1，设定卵磷脂与表面活性剂的质量比(m(卵磷脂)∶m(吐温-20))分别为1∶1，2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，按照节2.2.1方法制备脂质体，测定其包封率及粒径，结果如图4(b)所示.由图4(b)可知：当卵磷脂与吐温-20的质量比为1∶1时，所得粒径最小；当卵磷脂与吐温-20的质量比为1∶1，2∶1，4∶1时，包封率无显著性变化.考虑到表面活性剂过多会形成胶束[20]，故后续实验卵磷脂与吐温-20的质量比采用4∶1.

2.3.3 卵磷脂与胆固醇的质量比 固定鞣花酸质量浓度为25 μg·mL-1，水化时间为3 h，表面活性剂为吐温-20，卵磷脂与吐温-20的质量比为1∶1，设定卵磷脂与胆固醇的质量比(m(卵磷脂)∶m(胆固醇))分别为2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1，0∶1，按照节2.2.1方法制备脂质体，测定其包封率及粒径，结果如图4(c)所示.由图4(c)可知：当卵磷脂与胆固醇的质量比为8∶1时，所得包封率最大，粒径最小；随着胆固醇比例的增加，粒径逐渐减小，但超过一定质量比，包封率下降，这可能是由于胆固醇的增加导致膜的通透性增加，使包裹的鞣花酸渗出[21].

2.3.4 药物质量浓度 固定水化时间为3 h，表面活性剂为吐温-20，卵磷脂与吐温-20的质量比为1∶1，卵磷脂与胆固醇的质量比为8∶1，同时，设定鞣花酸的质量浓度(ρ)分别为15，20，25，30，35，40，45 μg·mL-1，按照节2.2.1方法制备脂质体，测定其包封率及粒径.当鞣花酸质量浓度大于35 μg·mL-1时，第二天溶液会发生聚沉现象，故对15，20，25，30 μg·mL-14个质量浓度进行整理，结果如图4(d)所示.为保证所得包封率最大，载药最多，选择鞣花酸质量浓度为25 μg·mL-1.

2.3.5 水化时间 固定其他因素不变，考察水化时间(th)分别为1，2，3，4 h时，包封率和粒径的变化情况，如图4(e)所示.由图4(e)可知：当水化时间为2 h时，包封率最大.考虑到水化为1 h时，茄形瓶上的薄膜未被完全水化为脂质体；当水化时间为3，4 h时,脂质体的结构被破坏，导致鞣花酸泄露；水化时间超过2 h后，粒径未有明显变化,故选择2 h为最优水化时间.

2.4 Box-Behnken 响应面法优化试验设计

单因素考察实验选取卵磷脂与胆固醇的质量比(A)、脂质体制备水化时间(B)、卵磷脂与吐温-20的质量比(C)作为对EA-FNL包封率影响较大的3个因素，并以鞣花酸的包封率(Y)为响应值，采用Box-Behnken响应面优化制备工艺.每个因素设置3个水平分别为低(-1)、中(0)、高(+1)，各因素水平，如表1所示.

2.4.1 回归模型的建立与方差分析 以包封率为指标，采用软件Design-Expert 8.0.6对数据(表2)进行方程拟合，由此得Y=(72.00-0.34A+1.51B-5.84C-2.84AB-0.067AC-1.13BC-6.56A2-13.31B2-2.04C2)/100，R2=0.982 5，P<0.05，拟合度良好.

对模型进行回归分析与显著性分析，结果如表3所示.失拟合F值为0.21，失拟合F值相对于纯误差不具有统计学意义，说明实验结果可靠.方程中C项具有高度统计学意义，说明影响脂质体包封率的最主要因素是卵磷脂与吐温-20的质量比.

表2 Box-Behnken设计与试验结果

表3 包封率回归模型方差分析

2.4.2 响应面优化与预测 运用软件绘制三因素对评价指标的三维响应面图，结果如图5所示.由图5可知：等高线趋于椭圆，三维图的曲线较陡，说明两因素交互作用的显著性越好；A与B的响应面的曲面较陡，B与C，A与C的响应面的曲面较平坦，说明卵磷脂与胆固醇的质量比与脂质体制备水化时间的交互作用对脂质体包封率的影响最大，欲使包封率最大化，应选择曲面最高点对应的水平最佳处方工艺，即卵磷脂与胆固醇的质量比为7.83∶1,脂质体制备水化时间为2.1 h,卵磷脂与吐温-20的质量比为2∶1，预测包封率为75.93%.

(a) A，B交互作用的响应面图 (b) A，B交互作用的等高线图

(c) A，C交互作用的响应面图 (d) A，C交互作用的等高线图

2.5 EA-FNL的粒径与Zeta电位

根据最终处方平行制备3组EA-FNL，测定其脂质体包封率、粒径与电位，测得柔性纳米脂质体包封率为(75.66±0.40)%，粒径为(178.60±4.59) nm，聚合物分散性指数(PDI)为0.15±0.01，电位为(-30.60±0.92) mV.根据透射电镜图可知脂质体呈球形，其粒径大小与激光测定仪测定结果相符.EA-FNL的粒径分布图及电镜照片，如图6,7所示.图6中：I为强度.

图6 EA-FNL的粒径分布图 图7 EA-FNL的电镜照片 Fig.6 Particle size distribution of EA-FNL Fig.7 Electron micrographs of EA-FNL

2.6 初步稳定性考察

按最优工艺制备EA-FNL，对存储温度进行考察，将脂质体混悬液分别置于4,25 ℃保存，于0，1，2，3，4，10 d取样,测定其包封率，观察其状态.脂质体在4，25 ℃环境中保存无明显差异，EA-FNL的稳定性，如图8所示.图8中：θ为温度；ts为采样时间.由图8可知：在第10 d，脂质体的包封率略微下降，粒径稍有变大.

(a) 包封率 (b) 粒径图8 EA-FNL的稳定性Fig.8 Stability of EA-FNL

2.7 体外透皮实验

2.7.1 离体鼠皮的制备 用水合氯醛将SD雄性大鼠麻醉并断颈处死，取腹部完整皮肤，将毛发用刀片刮净.然后，用刀片、镊子剔除皮肤下脂肪组织，将处理好的皮肤，用生理盐水清洗干净，浸泡30 min，用滤纸吸干水分，铺皮，用锡纸包裹，置于-80 ℃冰箱保存，临用24 h前用生理盐水解冻.

2.7.2 透皮实验 采用Franz扩散池法，将鼠皮角质层向上，固定于接收室与供给室之间，扩散池面积为2.2 cm2，体积为6 mL，为了便于直接进行高效液相色谱的测定，以甲醇-生理盐水为接收液(V(甲醇)∶V(生理盐水)=50∶50)，将2 mL EA-FNL加入供给室，控制温度为(37.0±0.5) ℃，转速为400 r·min-1，分别于1，2，3，4，6，8，10，12，24 h取出0.7 mL接收液，并加入0.7 mL新的接收液，取出的接收液过0.22 μm滤膜，按照节2.1.2进行色谱分析，计算累积透皮量Qn并记录结果(图9)，Qn的计算公式为

上式中：Vt为接收池体积；ρn为n次取样点质量浓度；ρn-1为n-1次取样点质量浓度；Vs为每次的取样体积；S0为渗透面积.

图9 EA-FNL的累积渗透量Fig.9 Cumulative release of EA-FNL

实验结束后，取下鼠皮，将表面残留药物擦拭干净，取透皮处皮肤，剪碎，加入1.0 mL甲醇匀浆，匀浆液转移至离心管中，涡旋混匀，12 000 r·min-1离心10 min，残渣用0.5 mL甲醇重提一次，合并两次上清液，混匀，定容至2 mL[22].进行色谱分析，24 h后EA-FNL的皮肤滞留量为13.77 μg·cm-2.

3 讨论

以胆固醇、卵磷脂等为原料，通过薄膜分散法制备EA-FNL，并以包封率为考察指标,研究柔性纳米脂质体的最佳制备工艺.由于鞣花酸溶解度低等问题，导致EA-FNL的制备难度较高.脂质体包封率有以下3个影响因素.1) 卵磷脂与胆固醇的质量比.卵磷脂与胆固醇的质量比对脂质体结构及稳定具有重要影响，胆固醇是脂质体膜的重要组成部分，对脂质体的流动性及膜的稳定性具有双向调节作用，合适的比例有利于增加膜的刚性，提高脂质体包封率[23-24].2) 水化时间.水化时间过短，会导致水化不完全，不能很好地将药物嵌入脂质体的双分子层中；水化时间过长，又可能破坏脂质体的结构.3) 卵磷脂与吐温-20的质量比.卵磷脂与吐温-20的质量比直接影响脂质体的形成，过多的表面活性剂可形成胶束，合适比例的表面活性剂可以减小脂质体粒径，但表面活性剂成膜性较差，其用量直接影响脂质体的稳定性[25].

经过单因素实验和Box-Behnken 响应面优化最终确定的EA-FNL最佳处方：卵磷脂与胆固醇的质量比为7.83∶1，脂质体制备水化时间为2.1 h，卵磷脂与吐温-20的质量比为2∶1.按最佳处方制备EA-FNL，其稳定性仍有待提高，可增加影响因素的考察，例如，水化温度、搅拌速度、表面活性种类，以及聚乙二醇类等稳定剂[26].

脂质体是一种优秀的药物载体，具有良好的生物亲和性，普通的脂质体不适用于皮肤给药，难以透过皮肤角质层到达皮肤深层，FNL通过降低双分子层的界面张力，增加角质层中双分子层的流动性，从而提高被包裹药物进入皮肤的通透性[27].通过体外渗透实验考察EA-FNL的累积透皮量，EA-FNL的透皮率较好，皮肤滞留量较高.今后的工作将进一步考察EA-FNL的稳定性与复配性的问题，并开展动物实验进行验证，未来期望将鞣花酸柔性纳米脂质体应用于化妆品中，同时，也为柔性纳米脂质体作为药物载体在经皮给药的应用提供研究思路.