辐照协同甲酸分离油茶壳中纤维素、木质素和木糖的工艺研究

武小芬 陈 亮 齐 慧 张 勇 周毅吉 邓 明 王克勤

(湖南省农业科学院/湖南省核农学与航天育种研究所/湖南省农业生物辐照工程技术研究中心，湖南 长沙 410125)

油茶壳(Camellia oleifera shell)是油茶籽果实外种皮，占茶果干重的30.16%～34.10%，其壳富含木质素、木聚糖和纤维素，含量分别为42.21%、27.50%和19.87%[1-2]，常作为工业原料，用来制备活性炭[3]、木糖[3]、糠醛[4]、木糖醇[5]和膳食纤维[6]等。油茶壳中富含的木质纤维素成分，将其分离后进行高值化利用，不仅可以提高油茶壳的利用效率，同时也能够促进油茶产业的增值。

目前，有机溶剂分离法因其环境友好、成本投入低和溶剂回收率高等优点，已广泛应用于生物质木质纤维素组分分离[7-8]。相比醇类，有机酸如甲酸和乙酸可以很好地溶解木质素，且在常压、相对较低温度(＜110℃)就能获得较好的分离效果[9-10]。何伟等[11]研究发现棉秆在80%甲酸反应体系中，90℃反应3 h，木质素得率为55.7%。Snelders 等[12]研究发现小麦秸秆在甲酸∶乙酸∶水(体积比3∶5.5∶1.5)组成的反应体系中，105℃反应3 h，纤维素得率和纯度分别为48%和63%，木质素脱除率达98%。Shui 等[7]研究发现玉米秸秆在甲酸∶乙酸∶水(体积比6∶3∶1)反应体系中，90℃反应180 min，纤维素得率为53%、纯度为85%，木质素得率为38%、纯度为44%。上述研究均表明甲酸能够有效分离生物质中的纤维素和木质素，但得率或纯度有待进一步提高。因此，本研究结合其他的预处理方法，先破坏木质纤维素的交联结构，有利于提高分离效率。

高能射线(γ 射线、电子束)辐照处理可以破坏木质纤维素结构，使多糖链发生断裂，形成羧基和醛基[13]。辐照产生的这些弱酸性基团在水溶液条件下可以催化木质纤维素进一步断链解聚，若将其应用于木质纤维素组分分离的预处理具有很好的效果。Zhou等[14]采用γ-戊内酯和水组成的溶剂体系(40∶60，m∶m)分离800 kGy 辐照处理的芦苇杆木质纤维素，于170℃反应1 h，纤维素提取率和纯度分别为83%和86%，木质素和半纤维素的去除率分别为90%和97%。武小芬等[15]研究了辐照协同甲酸分离玉米芯纤维素、木质素和木糖，结果表明400 kGy 辐照处理玉米芯，采用甲酸分离的木质素和纤维素纯度分别较对照提高16.11%和14.53%，木糖得率提高41.10%。以上研究均说明协同辐照处理可以提高木质纤维素各组分的分离效果。为了提高甲酸分离油茶壳木质纤维素的提取率和纯度，本试验在上述研究基础上以辐照处理后的油茶壳为材料，系统研究不同辐照剂量、反应温度和反应时间对甲酸一步分离油茶壳纤维素、木糖和木质素得率和纯度的影响，旨在得出辐照协同甲酸分离油茶壳木质纤维素的最佳工艺，为油茶壳全组分生物炼制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶壳由湖南大三湘茶油有限公司提供，自然晾干后储存于阴凉干燥环境中，备用。葡萄糖、木糖、纤维二糖均为标准品，购于美国Sigma 公司；甲酸、硫酸均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；试验用水为去离子水。

1.2 主要仪器与设备

辐射源活度2.96×1016Bq60Co-γ 辐照装置，湖南省核农学与航天育种研究所；FW177 高速粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；JJ-6 恒速搅拌器，江苏金仪仪器科技有限公司；DZKW-s-4 电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；GZX-9246 电热鼓风干燥箱、SHZ-C 水浴恒温振荡器、YXQ-50SII 立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；BlueStar A 紫外分光光度计，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；RE-2000B 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；UltiMate 3000高效液相色谱，美国赛默飞世尔科技有限公司；Eco-S15纯水系统，上海和泰仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 辐照处理 将1 kg 油茶壳原料装于金属箱(20 cm×20 cm×40 cm)中，室温下进行动态辐照处理，辐射源活度2.96×1016Bq。样品辐照剂量分别为0(对照)、200、400、600、800 kGy。

1.3.2 机械粉碎 分别取经不同剂量辐照处理后的油茶壳进行粉碎，每次投料200 g，粉碎15 s，收集颗粒小于40 目的样品，称重。按照公式计算获得1 kg 过40 目筛的油茶壳粉末所需粉碎能耗(kWh):

式中，m 为粉碎后获得过40 目筛油茶壳粉末，质量1 000 g；m40为每200 g 油茶壳粉碎后过40 目筛样品质量，g；t 为粉碎时间(15/3 600)，h；P 为仪器功率，1.2 kW。

1.3.3 油茶壳成分分析 水分含量测定:参照国标GB 5009.3-2016[16]。

水溶性成分测定:称取2.0 g(精确至0.000 1 g)样品，按固液比1∶30(g·mL-1)加60 mL 蒸馏水于三角瓶中，于50℃、130 r·min-1条件下水浴反应2 h，抽滤，滤渣用少量蒸馏水冲洗3 次，105℃烘干至恒重，合并滤液和冲洗液，定容至100 mL(即为水浸出液)，用于分析水溶性单糖和多糖的含量。

式中，m1为样品干重；m2为水洗后残渣干重。

纤维素、木聚糖和木质素含量测定:参照美国国际可再生能源实验室的分析方法[17]。

葡萄糖和木糖含量采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定[17]，色谱条件为:Aminex HPX-87H(7.8 mm×300 mm)色谱柱，流动相为0.005 mol·L-1H2SO4溶液，流速0.6 mL·min-1，示差折光检测器，柱温55℃，柱后冷却温度30℃，检测器温度45℃，进样体积10 μL。

水溶性组分中葡萄糖和木糖的测定[18]:0.005 mol·L-1硫酸将水浸出液稀释至合适倍数后，采用HPLC 测定葡萄糖和木糖含量。

水溶性组分中葡聚糖和木聚糖的测定[18]:量取7 mL 水浸出液，加入0.25 mL 72%硫酸，于121℃反应1 h，冷却，用0.005 mol·L-1硫酸稀释至合适倍数，采用HPLC 测定葡萄糖和木糖含量，分别乘以系数0.9 和0.88，换算为葡聚糖和木聚糖含量。

1.3.4 粒度分布 在相同的粉碎条件下(一次投料量200 g，粉碎15 s)，取50 g 粉碎后的样品，分别记录通过孔径(d)为0.850、0.425、0.250、0.180、0.125、0.075 mm 标准筛的样品质量，计算样品的粒度分布。

1.3.5 油茶壳纤维素、木质素和木糖分离方法 研究辐照剂量(0、200、400、600、800 kGy)，反应温度(80、90、100℃)和反应时间(2、3、4 h)对油茶壳纤维素、木质素和木糖的分离效果。称取10.0 g(精确至0.000 1 g)样品于250 mL 直三口烧瓶，按1∶10(g·mL-1)加入100 mL 88%甲酸溶液，80 ～100℃水浴反应2 ～4 h，搅拌速度200 r·min-1。反应结束后抽滤，滤渣用100 mL 88%甲酸溶液冲洗，再用去离子水冲洗至中性，最后于60℃烘干，即为纤维素。滤液采用60℃减压浓缩至近干，浓缩液加入7 倍体积的蒸馏水，析出木质素，抽滤，滤渣采用去离子水清洗至中性，于60℃烘干，即为木质素。收集滤液，减压浓缩去除甲酸，即为木糖。

1.3.6 油茶壳纤维素、木质素和木糖提取率和纯度分析 根据公式计算纤维素、木质素和木糖提取率:

式中，m 为油茶壳干重；mc、ml和mx分别为分离获得纤维素干重、木质素干重和滤液中木糖质量；pc和pl分别为分离获得的纤维素和木质素纯度；wc，wl和wx分别为油茶壳中纤维素、木质素和木聚糖的含量。

根据公式计算纤维素、木质素纯度[18]:

式中，msc和msl分别为两步硫酸水解测定的纤维素和木质素含量；mc和ml分别为分离获得纤维素和木质素干重。

1.4 数据处理

采用Excel 2003 和Origin 8.0 进行数据图像处理，SPSS 17.0 进行数据统计和差异显著性分析，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 辐照处理对油茶壳粉碎能耗和粒度分布的影响

由图1-A 可知，在0～400 kGy 剂量范围内，随着辐照剂量的增加，油茶壳粉碎能耗下降，400 kGy 剂量辐照处理的油茶壳与对照相比，节约能耗43.59%，当辐照剂量大于400 kGy，粉碎能耗下降趋势变缓。将粉碎能耗对辐照剂量进行曲线拟合，拟合度R2达到0.899。由图1-B 可知，随着辐照剂量的增加，油茶壳粉碎后粗颗粒粉末所占比例逐渐减少，细颗粒含量逐渐增加，当辐照剂量达到800 kGy 时，d ＜0.075 mm 颗粒所占比例达到41.38%。说明辐照处理后油茶壳更加容易粉碎，从而使粉碎能耗降低，粉碎后颗粒粒径更小。

图1 辐照处理对油茶壳粉碎能耗(A)和粒度分布(B)的影响Fig.1 Effect of irradiation on crushing energy consumption (A) and particle size distribution (B) of camellia oleifera shell

2.2 辐照处理对油茶壳组成成分的影响

由表1可知，油茶壳中纤维素、木聚糖和木质素均随辐照剂量的增加逐渐降低，其中木聚糖降幅最大，其次为纤维素，木质素最难降解。随着辐照剂量的增加，油茶壳水溶性组分逐渐增多，水洗液中的葡萄糖和木糖及葡聚糖和木聚糖含量均呈增加趋势，当辐照剂量为800 kGy 时，水溶性组分含量最大(38.51%)，水溶性木糖和木聚糖含量均达到最大值，分别为43.07 mg·g-1和105.52 mg·g-1。说明辐照处理后油茶壳中纤维素、木聚糖等成分发生降解，由不溶性变为水溶性，从而使水洗液中糖含量增加。

2.3 油茶壳纤维素、木质素和木糖分离工艺研究

2.3.1 辐照剂量对油茶壳纤维素、木质素和木糖分离效果的影响 由图2-A 可知，当辐照剂量从0 增加至200 kGy 时，油茶壳纤维素的提取率显著升高至最大值(91.90%)，随后随着辐照剂量的增加逐渐降低；当辐照剂量为0～400 kGy 时，油茶壳木质素的提取率显著升高，辐照剂量为400 kGy 时，其提取率为46.07%，辐照剂量继续增加，提取率差异不显著；油茶壳木糖的提取率随着辐照剂量的增加呈升高趋势，在辐照剂量为800 kGy 时达到最大值(76.31%)，其中0 ～400 kGy各处理组之间差异显著。由图2-B 可知，当辐照剂量为0～400 kGy 时，甲酸分离获得的油茶壳纤维素纯度逐渐增加，辐照剂量为400 kGy 时达到最大值(40.40%)，辐照剂量继续增加，纯度稍有下降，总体变化差异均不显著；当辐照剂量为0 ～600 kGy 时，分离获得的木质素纯度逐渐升高，辐照剂量为600 kGy 时达到最大值(82.24%)，且400 ～600 kGy 剂量范围内差异不显著。综合考虑分离效果和辐照成本，选择最佳辐照剂量为400 kGy，此条件下，纤维素、木质素和木糖的提取率分别为86.75%、46.07%和62.04%，纤维素和木质素纯度分别为40.40%和81.39%。

表1 辐照处理后油茶壳组成成分的变化Table1 Changes in composition of camellia oleifera shell after irradiation pretreatment

图2 辐照剂量对甲酸分离油茶壳纤维素、木质素和木糖提取率(A)和纯度(B)的影响Fig.2 Effect of irradiation dose on extraction rate(A) and purity (B) of cellulose，lignin and xylose from camellia oleifera shell by formic acid separation

2.3.2 反应温度对油茶壳纤维素、木质素和木糖分离效果的影响 由图3-A 可知，随着反应温度的升高，油茶壳纤维素提取率逐渐降低，80℃时纤维素提取率最高为90.85%；油茶壳木质素的提取率随着反应温度的升高逐渐升高，100℃时达到最大值(47.90%)，80℃和90℃加热组的油茶壳木质素提取率存在显著差异，当温度继续提高，差异不显著；随着反应温度的升高，油茶壳木糖提取率显著升高，100℃时达到最大值(96.37%)。由图3-B 可知，随反应温度的升高，纤维素和木质素纯度均显著增加，100℃时均达最大值，分别为45.35%和91.92%。

图3 反应温度对甲酸分离油茶壳纤维素、木质素和木糖提取率(A)和纯度(B)的影响Fig.3 Effect of different reaction temperature on extraction rate(A) and purity (B) of cellulose，lignin and xylose from camellia oleifera shell by formic acid separation

2.3.3 反应时间对油茶壳纤维素、木质素和木糖分离效果的影响 由图4-A 可知，经过3 h 反应，油茶壳纤维素、木质素和木糖的提取率均达到最大值，分别为89.94%、47.74%和96.37%，继续延长反应时间，纤维素的提取率显著下降，木质素和木糖提取率无显著变化；由图4-B 可知，纤维素和木质素纯度也均在反应3 h 时达到最大值，分别为45.05%和91.92%，继续延长反应时间，纤维素纯度显著降低，木质素纯度无显著变化。

图4 反应时间对甲酸分离油茶壳纤维素、木质素和木糖提取率(A)和纯度(B)的影响Fig.4 Effect of different reaction time on extraction rate(A) and purity (B) of cellulose，lignin and xylose from camellia oleifera shell by formic acid separation

3 讨论

本研究结果表明，经辐照处理后油茶壳粉碎能耗降低，400 kGy 辐照处理后油茶壳粉碎能耗比对照节约43.59%，Liu 等[19]研究表明经800 kGy 剂量辐照处理后木质纤维素材料的粉碎能耗是未处理材料的1/3～1/4。粉碎过程是一个能量消耗的过程，降低粉碎能耗有助于降低整个工艺成本。本研究发现，油茶壳粉碎后细颗粒样品所占比例随辐照剂量增加而增加，800 kGy 辐照处理油茶壳，粉碎后d＜0.075 mm 和d＜0.125 mm 颗粒所占比例分别达到41.38%和78.56%，Zhang等[20]对辐照处理后油菜秸秆粒度分布和比表面积变化的研究也发现，随着辐照剂量增加颗粒直径逐渐减小，同时比表面积显著增加，这有利于底物和溶剂的充分接触，提高样品的反应性能。陈亮等[21]和Wang等[22]研究发现，辐照作为一种有效的预处理方法能够有效破坏木质纤维素的结构，改变生物质的物理化学特性，有利于后续反应的进行。辐照处理后油茶壳纤维素、半纤维素发生降解，水溶性葡聚糖和木聚糖含量均增加，有利于甲酸提取过程中提高木糖的提取率。

比较不同辐照剂量处理，400 kGy 剂量辐照处理的油茶壳，在甲酸浓度为88%的体系中分离纤维素、木质素和木糖效果最佳。在0 ～400 kGy 剂量范围内，增加辐照剂量对提高甲酸分离纤维素、木质素和木糖的效果具有促进作用，这可能是由于经辐照处理后，生物质表观结构被破坏，形成较多孔洞[23]，有利于分离过程中甲酸与底物的接触；同时，经辐照处理后木质纤维素的热稳定性下降，反应活化能降低[24-26]，样品更容易发生反应；但辐照剂量继续增大，会导致纤维素降解程度加剧，影响纤维素的提取率，同时也会增加工艺成本。反应温度和时间对甲酸提取效果也具有一定影响，通常温度越高，纤维素和半纤维素水解越剧烈[7]，所以100℃条件下甲酸提取会导致纤维素的提取率降低，但木糖和木质素提取率增高，同时纤维素和木质素的纯度也最高。反应时间为3 h 时，甲酸提取效果最佳，反应时间较短，不利于甲酸与底物的充分接触，反应时间过长，半纤维素降解产生的有机酸不断积累，导致纤维素发生水解影响提取率，同时长时间高温反应会造成木糖进一步降解[27]。

徐小乐等[28]采用甲酸-乙酸体系对苎麻麻骨中的纤维素和木质素进行提取分离，当甲酸∶乙酸∶水的比值为45∶35∶20，固液比为1∶20(g·mL-1)，提取温度为100℃时，纤维素得率为66.54%，木质素得率为35.10%。由于木质纤维素结构紧密，直接进行分离产物的得率和纯度均较低，通过辐照处理有利于提高分离效果。本研究采用的油茶壳经400 kGy 辐照处理后，在88%甲酸体系中100℃反应3 h，纤维素、木质素、木糖的提取率分别为89.94%、47.74%和96.37%，分离获得的纤维素和木质素纯度分别为45.05%和91.92%。但辐照处理成本相对较高，通过提高反应温度和加入催化剂等方法进一步降低辐照剂量，将是后续的研究方向。

4 结论

适当的辐照处理能够破坏油茶壳木质纤维素结构，提高甲酸分离木质素、纤维素和木糖的纯度和提取率。本研究结果表明，当辐照剂量低于400 kGy，增加辐照剂量有利于提高甲酸分离油茶壳纤维素、木质素和木糖的效果，说明辐照处理有利于甲酸分离生物质中木质纤维素组分。400 kGy 辐照剂量处理的油茶壳，在88%甲酸体系中，100℃反应3 h，纤维素和木糖的提取率分别为89.94%和96.37%，木质素纯度为91.92%，说明辐照协同甲酸分离木质纤维素效果好。若要进一步利用分离获得的组分，需对其组成和结构进行深入分析，这是本研究的不足之处，也是后期有待研究的方向。