CRISPR/Cas9介导的番茄SlMAPK6突变对植株形态的影响

岳宁波 李云洲 王 勇 高 彬 吴 浪 须 文 闫见敏 秦 蕾

(1贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025；2中国农业大学园艺学院，北京 100083；3 东北农业大学园艺学院，黑龙江 哈尔滨 150000)

番茄(Solanum lycopersicom)属茄科番茄属经济作物，因其含有番茄红素、类黄酮、β-胡萝卜素等营养元素深受人们喜爱[1-2]。然而，各种不良环境对番茄的生产造成了严重威胁。优化番茄的农艺性状是提高番茄产量的重要途径。侧枝及根系的发育是番茄生产中重要的农艺性状，良好的植株形态对番茄的生长发育具有重要影响。作物的水分和养分均通过根系获取[3]，理想的根系和枝条结构是影响作物产量的重要因素[4-5]。此外，根系还能为植株提供机械支持，产生激素，影响植株的生长发育及生理生化过程[6]。研究发现，发达的植株根系，不仅能够提高作物氮素的利用效率，而且能提高产量，根系较发达的植株在养分及水分获取中拥有更强的竞争力[7]。增加侧根形成可以促进整个番茄植株发育，从而提高番茄的产量[8]。

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)普遍存在于真核生物，且在进化过程中高度保守，能够控制细胞的分化，参与真核生物的应激反应[9-10]。MAPK 级联反应途径主要由MAPK、MAPK 的激酶(MAP kinase kinase，MAPKK)、MAPKK的激酶(MAP kinase kinase kinase，MAPKKK)三部分组成[11-12]，几乎参与了植物生长发育的每个过程[13]。同时，MAPK 还参与生长素、乙烯、脱落酸等植物激素的信号转导途径[14-16]。MAPK 按照结构的不同，分为A、B、C、D 共4 个亚组，其中SlMAPK6 处于B 亚组。孔福苓[17]通过顺式元件分析发现，SlMAPK6 存在分生组织表达、胚乳表达、中胚层发育相关转录因子等相关元件，推测其在番茄发育过程中也发挥重要作用。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9)基因编辑技术在2013年首次应用于植物基因编辑[18]。在CRISPR系统中，单导向RNA(single-guide RNA，sgRNA)与Cas9 核酸酶结合形成稳定复合物，对靶标DNA 进行切割[19-20]，在靶标DNA 双链断裂后，通过非同源末端连接或同源定向修复的激活机制，实现靶标基因的特异性编辑[21]。目前，CRISPR/Cas9 技术已应用于多种农作物，如番茄[22-23]、葡萄[24]、芥蓝[25]、水稻[26]等。

本研究通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术研究SlMAPK6 在番茄生长发育中的功能，旨在为番茄分子育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

番茄材料为矮番茄自交系，引自西北农林科技大学园艺学院番茄种质资源库，保存于贵州大学农学院植物病理实验室。

1.2 sgRNA 的设计与CRISPR/Cas9 载体的构建

通过Sol Genomics Network 网站获得SlMAPK6 基因(登录号:Solyc05G049970)序列，利用DISIGN 在线软件(http:/ /crispr.mit.edu/)对外显子部分进行靶位点分析，选择敲除3 个靠近基因编码区5′端、GC 含量不低于43%的靶序列[27]。通过DNA 重组技术构建CRISPR/Cas9 载体，命名为SlMAPK6-CRISPR，将SlMAPK6-CRISPR 载体转入农杆菌GV3101，在含有卡那霉素(Kan)的培养基上培养，菌落PCR 后进行测序验证，并将获得阳性菌株用70%甘油保存于-80℃，备用。

1.3 农杆菌介导的番茄遗传转化

番茄遗传转化方法参照Chetty 等[28]的方法并加以优化。番茄种子用1% NaClO 消毒3 ～5 min 后，用无菌蒸馏水冲洗6 次，置于1/2MS 培养基(2.21 g·L-1MS＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1琼脂)上，在25℃、16 h/8 h(光照/黑暗)的人工气候箱内培养。取生长7 d 的番茄无菌苗切取子叶，将其在预培养基[4.42 g·L-1MS ＋2.0 mg·L-16-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA) ＋0.1 mg·L-1吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA) ＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1琼脂]上培养2 d 后用于遗传转化。用含有目的载体的农杆菌菌液浸染1 ～2 min，转入共培养基(4.42 g·L-1MS ＋2.0 mg·L-16-BA ＋0.1 mg·L-1IAA ＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1琼脂)生长2 d；然后转入延迟筛选培养基(4.42 g·L-1MS ＋2.0 mg·L-16-BA ＋0.1 mg·L-1IAA ＋350 mg·L-1Timentin＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1琼脂)生长7 d；再转入抗性筛选培养基(4.42 g·L-1MS＋2.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1IAA ＋30 mg·L-1Kan＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1琼脂)进行筛选。每15 d 继代1 次，培养基同抗性筛选培养基。待不定芽长至1 ～3 cm 后转入生根培养基(2.21 g·L-1MS＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1琼脂)，长出不定根后移植至灭菌土壤中培养。

1.4 突变体植株的分子检测与表型鉴定

取抗性植株的叶片约0.1 g，采用CTAB 法提取基因组总DNA 进行PCR 扩增。PCR 扩增使用卡那基因特异性引物Kan-F 和Kan-R(表1)，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。根据靶序列设计特异引物，使用引物SlMAPK6-Target1-F、SlMAPK6-Target1-R，SlMAPK6-Target2-F、SlMAPK6-Target2-R 和SlMAPK6-Target3-F、SlMAPK6-Target3-R(表1)对所有抗性植株的基因组DNA 进行PCR 扩增验证靶点，以Off-target1-F、Offtarget1-R，Off-target2-F、Off-target2-R、Off-target3-F、Offtarget3-R、Off-target4-F、Off-target4-R(表1)进行PCR扩增检测是否脱靶并送样测序，使用DNAMAN 软件进行序列比对分析。对T1植株的表型进行观察和拍照，测量根长、茎径，统计不定根及侧枝数量。

2 结果与分析

2.1 sgRNA 的设计和SlMAPK6-CRISPR 载体的构建

根据软件分析，分别在SlMAPK6 基因的第1、第2、第3 个外显子上共选取了3 个靶位点，即GGTGGGC ACAGTAACATAAGAGG，GATAAAGCTTCTCAGTCAC ATGG，CCAACAGCTGACTGATGAACACT(图1)。回收纯化sgRNA-SlMAPK6 片段并与酶切后的载体连接，成功获得SlMAPK6-CRISPR 重组质粒(图2)。

图1 SlMAPK6 基因图示与靶点位置和序列Fig.1 Schematic of the SlMAPK6 gene，and the sgRNA target site and sequence

2.2 脱靶率检测

根据CRISPR-P 在线软件(http:/ /crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)检测SlMAPK6 可能存在的脱靶位点，在得分较高的外显子区域，随机选取4 个潜在脱靶位点对T1番茄植株进行脱靶验证，所用的脱靶验证引物见表1，PCR 验证后测序，并进行比对，结果显示，SlMAPK6 被成功编辑，可用于后续试验。

表1 试验中所用的引物Table1 The primers used in this study

图2 SlMAPK6-CRISPR 载体结构图Fig.2 Carrier structure of the SlMAPK6-CRISPR

表2 潜在脱靶序列的突变Table2 Potential off-target sites

2.3 CRISPR/Cas9 介导的SlMAPK6 基因突变类型的分析

对2 株突变株CRISPR-3、CRISPR-7 的SlMAPK6基因靶位点上下游序列比对分析发现，3 个靶点中target1 和target2 均有突变，靶点target3 在CRISPR-7株系中有突变，但在CRISPR-3 株系中并未发生突变(图3-C)。

CRISPR-3 株系在靶点target1 下游发生碱基替换，造成该突变株的编码氨基酸发生变化，替换碱基数为5 bp(图3-A)。CRISPR-7 株系在靶点target1 上有2 处碱基替换，而在该靶点下游有8 处碱基发生替换，其中有2～3 个碱基发生连续替换突变(图4-A)。

CRISPR-3 在靶点target2 上发生3 处碱基替换和1处碱基缺失，而CRISPR-7 在靶点target2 上发生2 处碱基替换、1 处碱基缺失和1 处碱基插入(图4-B)。2 个突变株系在靶点target2 发生碱基缺失位置相同(图3-B)。

CRISPR-7 在3 个靶点均发生了碱基替换，在靶点target2 出现碱基缺失和碱基插入(图4)；CRISPR-3在靶点target1 和target2 出现碱基突变，但在靶点target3 未发现突变(图3-C)。虽然2 个株系突变的方式和位置不同，但是2 个突变株的SlMAPK6 基因均被成功编辑。

2.4 CRISPR/Cas9 介导的SlMAPK6 基因突变株的表型

T0培养过程中发现，与野生型(WT)相比，突变株系都表现出了茎径增加、侧枝增加、根系更为发达的表型。将CRISPR-3 和CRISPR-7 的T1幼苗种植在灭菌的土壤中，在正常生长条件下，T1表现出根系更为发达、侧枝增多的表型。该表型自幼苗期开始至成熟期一直显著，在幼苗期，突变体CRISPR-3 和CRISPR-7 根长分别是WT 的2.13 倍和1.82 倍，且WT 无不定根，突变体拥有数量不一的不定根，根系面积也明显增大；突变体CRISPR-3 和CRISPR-7 的后代的侧枝数分别是WT 的1.69 倍和2.01 倍。在成熟期，突变体CRISPR-3 和CRISPR-7 根长分别是WT 的1.71 倍和1.61 倍，突变体的不定根显著增加，WT 均无不定根；突变体CRISPR-3 和CRISPR-7 后代的侧枝数分别是WT 的1.71 倍及1.55 倍。无论是幼苗期还是成熟期，突变体的茎径一直显著高于WT(图4和表3)。结合突变株系的序列分析结果(图3)及潜在脱靶位点(表2)验证可知，突变株中的SlMAPK6 基因已被成功敲除，且敲除矮番茄SlMAPK6 基因后促进了番茄植株的根系生长及侧枝发育。

表3 T1 野生型(WT)及突变体(CRISPR－3 和CRISPR－7)表型数据对比Table3 Comparison of phenotypic data of wild-type and mutant (CRISPR－3 and CRISPR－7) in T1 genegration

图3 CRISPR/Cas9 介导的番茄SlMAPK6 基因突变类型Fig.3 The type of CRISPR/Cas9 system-induced SlMAPK6 mutation in Solanum lycopersicum

3 讨论

本研究通过 CRISPR-Cas9 技术敲除番茄SlMAPK6，利用CRISPR/Cas9 系统传递Cas9 核酸酶和3 个sgRNA 进入番茄基因组，部分突变体植株实现了3 个sgRNA 靶标位点之间DNA 碱基或片段的缺失、替换和插入。本研究还发现番茄SlMAPK6 突变株CRISPR-3 和CRISPR-7 的形态普遍出现茎部增粗、侧枝增加、根系更为发达、不定根数量增加等现象。突变株CRISPR-7 在靶点target1、target2、target3 均有发生突变，突变株CRISPR-3 在靶点target1、target2 发生突变，在靶点target3 未发生突变，其中靶点target1 和target3 处的突变主要是碱基替换，而靶点target2 附近发生碱基插入和碱基缺失突变，使该基因编码区产生移码突变，导致SlMAPK6 蛋白翻译过程提前终止，从而使得SlMAPK6 蛋白失去原有的功能，这可能是造成番茄植株形态发生明显变化的主要原因。

图4 SlMAPK6 突变体(CRISPR－3 和CRISPR－7)T1与野生型表型Fig 4 SlMAPK6 mutants (CRISPR－3 and CRISPR－7)T1 and wild-type phenotypes

理想的植株形态是决定作物产量的核心因素[29]。植株侧枝及根系的发育主要受遗传、环境和激素的影响[5，30-31]。多项研究表明，MAPK 激酶信号通路参与调控植株的生长发育[9]。Shi 等[32]通过在烟草过表达GhMAPK7 促进了种子的萌发，且在同一条件下过表达植株生长更快，叶片也明显大于野生型植株；Jia 等[33]发现，MKK7-MPK6 级联反应磷酸化PIN1 蛋白，调控拟南芥枝条分支、花丝生长和侧根的形成。激素也是影响植株形态形成的重要因素，Deng 等[34]研究发现番茄生长素基因IAA15(SlIAA15)编码的蛋白质可调节植株中的生长素信号传导，反向遗传学方法证明SlIAA15 在调节植物生长发育方面发挥重要作用，SlIAA15 下调株系表现为叶片及茎部的绒毛数量减少，同时降低植株的顶端优势并伴随腋芽、侧根数目增加和坐果减少。本试验同样发现SlMAPK6 敲除株系表现出侧根数目增多，但坐果数增加，推测SlMAPK6 与SlIAA15 分别调控番茄的侧枝及侧根发育途径，且不在同一个通路上，还需后续研究以证实。

独脚金内酯是调节植株地上和地下形态形成的植物激素[35-37]。Kapulnik 等[38]发现，在拟南芥中，独角金内酯会抑制拟南芥侧根的形成，番茄类胡萝卜素裂解双氧合酶8(SlCCD8)可以调控番茄独脚金内酯的合成；Kohlen 等[39]通过RNAi 技术干扰SlCCD8 评估其在番茄根际信号传导中的作用，SlCCD8 敲除株系表现出腋芽分支增加、植株高度降低、节数增加和不定根增多等现象。Gao 等[40]通过 CRISPR-Cas9 获得的NtCCD8 的突变体也发现了分枝增加、侧根增多的表型，SlCCD7 编码一种能够裂解环状和非环状类胡萝卜素的酶，Vogel 等[41]通过表达SlCCD7 反义链干扰其表达，结果显示SlCCD7 干扰株系表现出分枝显著增加。SlCCD7、SlCCD8 干扰株系的表型都与本试验SlMAPK6敲除株系极为相似，暗示SlMAPK6 很可能是通过SlCCD7、SlCCD8 调控独脚金内酯来调控根系的生长发育。SlMAPK6 敲除株系表型是否与植物激素IAA、细胞分裂素(cytokinin，CK)及独角金内酯的含量有关，在后续研究中，将会对这些问题进行进一步研究。

4 结论

本研究通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术对番茄SlMAPK6 基因进行敲除突变，获得2 个突变体CRISPR-3 和CRISPR-7，在正常生长条件下显著促进了番茄的枝条及根系的生长发育。SlMAPK6 基因敲除突变体将为培育具有良好植株形态和功能的番茄品种提供材料基础，同时为进一步探究SlMAPK6 的功能奠定基础。