气温升高与干旱对灵武长枣果实糖积累、蔗糖代谢关键酶及相关基因表达的影响

2020-10-09陈丽华杨喜盟宋丽华

核农学报 2020年9期

陈丽华杨喜盟贾昊宋丽华

(宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)

全球气候变暖已成为近百年来全球气候变化的主要特征[1]。据预测，21世纪末气温还将升高1.5 ～4.5℃[2-4]。有专家认为，随着气候的变暖，土壤水分蒸发量相应增加，西北地区的气候将向干热方向演化，干旱程度将会加重[5]。在此局势下，近50 多年来，宁夏气温也逐年升高，降水量总体呈下降趋势[6-8]，气温升高与干旱加剧现象十分明显[9]。

灵武长枣(Ziziphus jujubaMill cv. Lingwu changzao)又名马牙枣，属鼠李科枣属，是宁夏特色经济林优良鲜食枣品种，果实富含维生素C 和多种氨基酸，兼具药食同源的特性，有显著的生态、社会与经济效益[10-12]。灵武长枣果实中糖的种类和含量直接影响果实的营养价值、风味口感、色泽等品质性状，而温度、水分、光照等环境因子又影响果实的糖代谢[13-15]。目前，对于苹果[16]、猕猴桃[17]、葡萄[18]等果实糖积累、蔗糖代谢关键酶及相关基因表达已有研究，但鲜见有关对枣的研究报道。对灵武长枣的研究主要集中于产业化生产和鲜果保鲜、生物学特性、种质资源调查和品种选优等方面[18-19]，对果实品质形成的原因仍缺少深入而系统的研究，在果实发育过程中糖的积累规律及其酶学机理方面的研究也相对较少。本试验通过测定大气升温与土壤干旱交互处理下不同发育时期灵武长枣果实的糖积累、蔗糖代谢关键酶及相关基因表达水平，揭示气温升高与干旱交互作用下灵武长枣果实糖分积累、蔗糖代谢关键酶及基因表达水平的变化规律，阐明三者之间的关系，并从分子水平探究其影响机制，旨在为宁夏灵武长枣生产实践应对全球气候变化提供理论指导与科技支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试验地概况

以6年生灵武长枣嫁接苗为试验对象，试验于2018年4月底至10月初在宁夏大学实验农场进行。试验地位于宁夏永宁县(38°47′07″N，106°04′00″E，海拔1 116.8 m)，属中温带干旱气候区，年均气温8.5℃，年均日照时数3 000 h，日温差13℃，年均≥10℃积温3 300℃，无霜期140～160 d，年降水量180 ～200 mm，土壤为灌淤土[20]。

1.2 试验设计

采用大气温度和土壤含水量双因素完全区组试验设计。大气温度设置2 个水平:自然环境大气温度(T1)，升高大气温度(T2)，T2 温度为T1 ＋(2.0±0.5℃)；土壤含水量设置3 个梯度:正常土壤供水(D1，田间最大持水量的70%～75%)，中度干旱(D2，田间最大持水量的50%～55%)，重度干旱(D3，田间最大持水量的30%～35%)。共6 个处理，以D1T1 为对照(CK)。每处理3 次重复，共18 棵样株。于枣树萌芽期开始同时进行气温升高与干旱处理，至枣果成熟后结束。

采用自制开顶气室模拟大气升温环境。开顶气室由口径为4 cm×4 cm 的镀锌方管框架和无色透明棚膜组成，气室高2.3 m，底部边长2 m×2 m，四周围绕无色透明棚膜，形成四棱柱形开顶气室。对升温处理样株套盖开顶气室，常温处理样株套盖通透型开顶气室，确保空气对流及气室内外大气温度一致。气室内大气温度采用ZWSN-C-A 紫藤科技系列农用温室型多路无线数据采集设备(天津紫藤科技股份有限公司)完成自动实时监测和记录。每处理样株的土壤含水量控制采用塑料地膜进行水分隔离，沿着植株树干四周直径1.5 m 处，开沟深度为80 cm，用塑料地膜进行水分隔离，以保持各处理土壤含水量。采用GG-001B 单头有线太阳能自动灌溉系统(上海艾美克电子有限公司)进行土壤含水量监测与控制。

试验期间，T2 环境的温度变化曲线与T1 具有相似的趋势(图1)，总体均呈先上升后下降的趋势。

图1 不同温度控制下气温变化Fig.1 Temperature changes under different temperature control

试验期间，不同干旱程度下土壤含水量变化如图2所示，各干旱处理(D1、D2、D3)土壤含水量在果实生长发育不同时期存在一定波动，但范围较小。D1 的土壤水分含量为19.00%～20.50%，其预值设为19%～20%；D2 的土壤水分含量为13.80%～15.00%，其预设值为14% ～15%；D3 的土壤水分含量为8.00% ～10.00%，其预设值为8%～9%。

图2 不同干旱程度下土壤含水量变化Fig.2 Changes of soil water content under different drought levels

分别于果实发育不同时期采集样株树冠东、西、南、北及上、中、下、里、外9 个方向的枣吊基部第二节处同一批开花结果无病虫害果实(约20 个)。将每处理重复样株果实混合均匀后分成两份，一份迅速放入液氮罐中带回，保存于-80℃冰箱用于蔗糖代谢关键酶活性及相关基因表达量的测定；另一份保存于4℃冰箱用于糖含量的测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 可溶性糖、淀粉含量的测定用蒽酮比色法测定灵武长枣果实的葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉含量[21-22]。

1.3.2 蔗糖代谢关键酶活性的测定酸性转化酶(acid invertase，AI)、中性转化酶(neutral invertase，NI)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthetase，SPS)、蔗糖合成酶合成方向(synthesis direction of sucrose synthetase，SS-s) 和蔗糖合成酶分解方向(direction activity of sucrose synthetase，SS-c)活性的测定参考文献[23-27]的方法。

1.3.3 蔗糖代谢关键酶基因相对表达量的测定取试验样品500 mg，采用改良CTAB 法[28]提取总RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA 质量(A260/A280)，利用cDNA Synthesis Kit Probegene MM061 试剂盒(江苏溥博生物科技有限公司)反转录cDNA。以ZjActin作为内参基因，内参及目的基因引物设计均交由Probegene公司(北京)完成，然后由上海生工合成。以合成的cDNA 为模板进行PCR 反应，反应体系:10 μL 模板cDNA，0.1 μL 上、下游引物，5 μL 2× SYBR Green qPCR Master Mix。反应程序:95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，运行40 个循环后72℃延伸7 min，最后4℃终止反应。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量，采用Heat map illustrator 对基因相对表达量进行制图。

1.4 数据分析

采用Excel 2016 对原始数据进行整理。果实糖含量数据在进行方差分析前进行反正弦转换。采用SPSS 25.0 进行双因素方差分析与各处理间差异显著性检验(Duncan 新复极差法)，采用Origin 2018 制图。

2 结果与分析

2.1 气温升高与干旱对灵武长枣果实糖含量的影响

2.1.1 对果实葡萄糖含量的影响由表1可知，相同土壤含水量水平下，T2 果实成熟期葡萄糖含量均高于T1，表明气温升高增加了果实葡萄糖含量。同一大气温度环境中，不同土壤含水量水平下果实成熟期葡萄糖含量均表现为D2>D1>D3，表明中度干旱增加了果实葡萄糖含量，重度干旱减少了果实葡萄糖含量；与D1 相比，D2 果实葡萄糖含量在成熟期分别增加了0.71(T1)和0.83(T2)个百分点，D3 分别降低了1.90(T1)和2.73(T2)个百分点。表明气温升高增强了中度干旱对果实葡萄糖积累的促进作用，加剧了重度干旱对果实葡萄糖积累的抑制作用。

表1 气温升高与干旱对灵武长枣果实葡萄糖含量的影响Table1 Effect of elevated temperature and drought on glucose content in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao /%

2.1.2 对果实果糖含量的影响由表2可知，在土壤含水量水平为D1 和D2 时，T2 果实果糖含量整体较T1 升高，而在土壤含水量水平为D3 时降低，表明气温升高增加了正常土壤供水和中度干旱条件下果实果糖含量，但减少了重度干旱下果实果糖含量。T1 中，不同土壤含水量水平下果实果糖含量除着色后期均表现为D3>D2>D1，表明干旱增加了果实果糖含量；2 种大气温度环境中，与D1 相比，D2 和D3 在着色中期果实果糖含量分别增加0.66 和1.62(T1)、0.67 和0.69(T2)个百分点。表明气温升高增强了干旱对果实果糖积累的促进作用。

2.1.3 对果实蔗糖含量的影响由表3可知，相同土壤含水量水平下，除幼果期外，T2 果实蔗糖含量均高于T1，表明气温升高增加了果实蔗糖含量。同一大气温度环境中，不同土壤含水量水平下成熟期果实蔗糖含量均表现为D2>D1>D3，表明中度干旱条件下更有利于果实蔗糖的积累；与D1 相比，D2 和D3 果实着色中期蔗糖含量分别增加了4.51 和4.62(T1)、2.20 和1.19(T2)个百分点。表明气温升高减缓了干旱对果实蔗糖积累的促进作用。

表2 气温升高与干旱对灵武长枣果实果糖含量的影响Table2 Effect of elevated temperature and drought on fructose content in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo /%

表3 气温升高与干旱对灵武长枣果实蔗糖含量的影响Table3 Effect of elevated temperature and drought on sucrose content in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo /%

2.1.4 对果实淀粉含量的影响由表4可知，相同土壤含水量水平下，T2 果实淀粉含量均高于T1，表明气温升高增加了果实淀粉含量。同一大气温度环境中，不同土壤含水量水平下果实淀粉含量在膨大期、着色初期和着色后期均表现为D3>D1>D2，表明重度干旱增加了果实淀粉含量，而中度干旱降低了果实淀粉含量；与D1 相比，D2 果实淀粉含量在成熟期分别降低了0.05 和0.05(T1 和T2)个百分点，而D3 分别增加了0.08 和0.10(T1 和T2)个百分点。表明气温升高增强了重度干旱对果实淀粉积累的促进作用。

表4 气温升高与干旱对灵武长枣果实淀粉含量的影响Table4 Effect of elevated temperature and drought on starch content in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo /%

2.2 气温升高与干旱对灵武长枣果实蔗糖代谢关键酶活性的影响

2.2.1 对AI 活性的影响由表5可知，相同土壤含水量水平下，T1 果实AI 活性均高于T2，表明气温升高降低了果实的AI 活性。同一大气温度环境中，不同土壤含水量水平下果实AI 活性在幼果期、着色初期和着色后期均表现为D2>D1>D3，表明中度干旱提高了果实AI活性，而重度干旱降低了果实AI 活性；与D1 相比，D2果实AI 活性在成熟期分别增加了8.62%和9.82%(T1和T2)，而D3 则分别降低了13.36%和12.05%(T1 和T2)。表明气温升高减缓了中度干旱对果实AI 活性的提升作用，增强了重度干旱对果实AI 活性的提升作用。

表5 气温升高与干旱对灵武长枣果实AI 活性的影响Table5 Effect of elevated temperature and drought on AI activity in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo/(mg·g－1FW·h－1)

2.2.2 对NI 活性的影响由表6可知，3 种土壤含水量水平下，与T1 相比，除成熟期外，T2 中D1 和D2果实NI 活性均升高，而D3 降低，表明气温升高在正常土壤供水与中度干旱条件下提升了NI 活性，而在重度干旱条件下降低了NI 活性。与D1 相比，D2 和D3果实NI 活性在着色中期分别增加了7.94% 和56.08%(T1)、14.98%和3.38%(T2)。表明气温升高增强了中度干旱对果实NI 活性的提升作用，减缓了重度干旱对果实NI 活性的提升作用。

表6 气温升高与干旱对灵武长枣果实NI 活性的影响Table6 Effect of elevated temperature and drought on NI activity in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo/(mg·g－1FW·h－1)

2.2.3 对SPS 活性的影响由表7可知，3 种土壤含水量水平下，与T1 相比，T2 中D1 和D2 果实SPS 活性在着色后期和成熟期均升高，而D3 降低，表明气温升高在正常土壤供水与中度干旱条件下提升了SPS活性，而在重度干旱条件下降低了SPS 活性。同一大气温度环境中，除幼果期和成熟期外，果实SPS 活性均表现为D2>D1>D3，表明中度干旱提高了果实SPS活性，而重度干旱降低了果实SPS 活性；与D1 相比，D3 果实SPS 活性在成熟期分别降低了11.04%(T1)和45.34%(T2)，表明气温升高加剧了重度干旱对果实SPS 活性的抑制作用。

2.2.4 对SS-s 活性的影响由表8可知，3 种土壤含水量水平下，与T1 相比，T2 中D1 和D2 的果实SS-s活性在幼果期、膨大期和着色后期均升高，而D3 降低，表明气温升高在正常土壤供水与中度干旱条件下提高了SS-s 活性，而在重度干旱条件下降低了SS-s 活性。同一大气温度环境中，除着色初期外，果实SS-s活性均表现为D2>D1>D3，表明中度干旱提高了果实SS-s 活性，而重度干旱降低了果实SS-s 活性；与D1 相比，D2 果实SS-s 活性在成熟期分别增加了18.90%和18.56%(T1 和T2)，而D3 分别降低了22.87%和43.21%(T1 和T2)，表明气温升高减缓了中度干旱对果实SS-s 活性的提升作用，加剧了重度干旱对果实SS-s 活性的抑制作用。

表7 气温升高与干旱对灵武长枣果实SPS 活性的影响Table7 Effect of elevated temperature and drought on SPS activity in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo/(mg·g－1FW·h－1)

表8 气温升高与干旱对灵武长枣果实SS-s 活性的影响Table8 Effect of elevated temperature and drought on SS-s activity in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo/(mg·g－1FW·h－1)

2.2.5 对SS-c 活性的影响由表9可知，3 种土壤含水量水平下，总体来看，与T1 相比，T2 中D1 和D2 的果实SS-c 活性降低，而D3 升高，表明在正常土壤供水与中度干旱条件下气温升高降低了SS-c 活性，而在重度干旱条件下提升了SS-c 活性。T1 中，除着色后期和成熟期外，各土壤含水量水平下，果实SS-c 活性整体表现为D3>D2>D1，而T2 中表现为D3>D1>D2，表明重度干旱更有利于提升果实SS-c 活性。同一大气温度环境中，与D1 相比，D2 果实SS-c 活性在成熟期分别降低了16.18%(T1)、12.45%(T2)，而D3 分别增加了40.09%(T1)和45.49%(T2)。表明气温升高减缓了中度干旱对果实SS-c 活性的提升作用，增强了重度干旱对果实SS-c 活性的提升作用。

2.3 气温升高与干旱对灵武长枣果实蔗糖代谢关键酶基因表达的影响

2.3.1 对ZjAI基因相对表达量的影响由图3可知，相同土壤含水量水平下，T2 中果实成熟期的ZjAI基因相对表达量较T1 均上调；表明气温升高促了ZjAI基因的相对表达。在果实成熟期，T1 中，D2 和D3 果实的ZjAI基因相对表达量较D1 分别上调8. 69 和4. 39 倍；而T2 中，D2 果实的ZjAI基因相对表达量较D1 上调0. 57 倍，而D3 下调1. 15倍。表明气温升高加剧了重度干旱对ZjAI基因相对表达的抑制作用。

表9 气温升高与干旱对灵武长枣果实SS-c 活性的影响Table9 Effect of elevated temperature and drought on SS-c activity in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzo/(mg·g－1FW·h－1)

图3 气温升高与干旱对灵武长枣果实ZjAI基因相对表达量的影响Fig.3 Effect of elevated temperature and drought on ZjAI gene expression in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao

2.3.2 对ZjNI基因相对表达量的影响由图4可知，气温升高与干旱交互处理主要在果实发育前中期促使ZjNI1 和ZjNI2 基因表达上调，在果实发育后期促使ZjNI3、ZjNI4、ZjNI5 基因表达上调，且ZjNI5 在着色后期和成熟期上调水平较高，而ZjNI2 在幼果期上调水平较高，ZjNI3 和ZjNI4 表达水平整体相对较低。各处理在灵武长枣果实发育过程中，D3T2 的各基因上调幅度均最大。表明气温升高促使ZjNI基因表达上调，气温升高伴随干旱增强了ZjSPS基因的上调表达。

2.3.3 对ZjSPS基因相对表达量的影响由图5可知，气温升高与干旱交互处理主要在果实发育后期促使ZjSPS基因表达上调，其中ZjSPS1 和ZjSPS4 上调水平较高，而ZjSPS2 和ZjSPS3 上调水平较低，各处理在灵武长枣果实发育过程中，D3T2 的各基因上调水平均最大。表明气温升高促使ZjSPS基因上调表达，气温升高伴随干旱增强了ZjSPS基因的上调表达。

2.3.4 对ZjSS基因相对表达量的影响由图6可知，气温升高与干旱交互处理主要在果实发育后期促使ZjSS基因表达上调，其中ZjSS1 和ZjSS3 上调水平较高，而ZjSS2 上调水平最低。各处理在灵武长枣旱实发育过程中，D3T2 的各基因上调水平均最大。表明气温升高促使ZjSS基因上调表达，气温升高伴随干旱增强了ZjSS基因的上调表达。

3 讨论

糖积累是果实品质形成的关键，果实品质直接受糖含量和组成的影响。糖是大多数果实成熟时的主要储存物质，不同品种果实之间以及同一品种果实在不同的发育时期，糖的积累均存在差异[29-33]。王元基[16]在苹果果实糖代谢研究中发现，从幼果期开始适度干旱胁迫可以提高果实蔗糖、果糖含量。本研究发现，在气温升高与重度干旱处理后，灵武长枣果实生长发育过程中，淀粉含量始终维持在较低水平，且仅在幼果期出现最高含量，为1.04%。各处理在幼果至膨大期，果糖含量均存在一个小的上升阶段，而蔗糖含量却降至最低水平；在果实发育后期，葡萄糖和蔗糖含量均呈增加趋势，其中蔗糖含量上升较快，且在成熟期的最终含量约为葡萄糖的2～3 倍。由此可见，灵武长枣果实属于糖直接积累型。

图4 气温升高与干旱对灵武长枣果实ZjNI 基因相对表达量的影响Fig.4 Effect of elevated temperature and drought on ZjNI gene expression in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao

果实中糖的积累与其相关代谢酶密切相关，果实获得同化产物的能力主要由库强决定，而蔗糖代谢相关酶的活性对库强和糖卸载能力具有一定影响[22，34-35]，进而影响果实糖分的积累以及糖的组成。王文丽[18]对设施延后栽培葡萄的研究表明，在葡萄着色成熟期轻度水分胁迫可以有效促进果实中各类糖分的积累，重度水分胁迫在各生育期均会降低果实内葡萄糖以及总糖的含量，果实膨大期进行重度水分胁迫，会对后期果实SPS 活性有一定的抑制作用。在本研究中，中度干旱提高了灵武长枣果实AI、SPS、SS-s 活性，降低了果实中SS-c 活性，致使蔗糖的合成方向大于其分解方向，因而中度干旱胁迫有利于果实可溶性糖的积累，减少了果实淀粉含量；重度干旱下，蔗糖代谢酶活性恰好相反，致使蔗糖的分解方向大于其合成方向，催化蔗糖分解，因而重度干旱减少了果实蔗糖含量，增加了果实淀粉含量。由此表明，灵武长枣果实糖积累对干旱的响应可能取决于SPS 活性的高低及SS发挥活性的主要方向。

图5 气温升高与干旱对灵武长枣果实ZjSPS 基因相对表达量的影响Fig.5 Effect of elevated temperature and drought on ZjSPS gene expression in fruit of jujube cultivar Lingwuchangzao

果实中糖代谢关键酶与其相关基因表达密切相关，果实生长发育不同阶段，酶活性具有较大差异，这可能与酶基因在时空上的表达存在差异有关[36]。本研究发现气温升高与干旱胁迫处理下，ZjNI基因在果实发育前期上调表达明显，这与Davies 等[37]关于葡萄浆果中GIN1 和GIN2 基因在果实生长发育早期表达，在己糖积累开始之前急剧下降的结论一致。ZjAI、ZjSPS和ZjSS基因主要在果实发育后期上调表达，其中ZjNI1、ZjNI2、ZjSPS1、ZjSPS4、ZjSS1 和ZjSS3 基因的上调表达量较大，且均在气温升高伴随重度干旱处理下上调幅度较大。由此推测，ZjNI1 和ZjNI2 为ZjNI基因的主要表达基因，ZjSPS1 和ZjSPS4 为ZjSPS基因的主要表达基因，ZjSS1 和ZjSS3 为ZjSS基因的主要表达基因，气温升高促使蔗糖代谢相关酶主要表达基因表达量上调，且随着干旱的加剧，上调表达越明显。由此可知，果实糖代谢对干旱的响应较气温升高2.0℃更为敏感，这可能是由于升温的幅度较小，因而所产生的影响差异不明显。

4 结论

研究表明，在灵武长枣果实生长发育阶段，气温升高2.0℃与干旱处理未改变灵武长枣属于糖直接积累型和蔗糖积累型的基本模式，中度干旱胁迫有利于灵武长枣果实葡萄糖、果糖和蔗糖的积累，重度干旱胁迫减少了葡萄糖含量，增加了淀粉含量，气温升高增加了葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉含量。干旱在灵武长枣果实发育前期提高了NI 活性，后期降低了NI 活性；中度干旱提高了果实AI、SPS 和SS-s 活性，而重度干旱恰好相反，且提升了果实SS-c 活性，大气升温2.0℃时减缓了中度干旱的影响作用，加剧了重度干旱的影响作用；SPS 和SS-s 为促进蔗糖、葡萄糖积累的关键酶，NI 为促进果糖积累的关键酶。气温升高与干旱处理在灵武长枣果实发育前期主要促进NI(ZjNI1、ZjNI2)和SPS(ZjSPS3)相关基因表达上调，后期主要促进AI、SPS(ZjSPS1 和ZjSPS4)、SS(ZjSS1 和ZjSS3)相关基因表达上调，气温升高2.0℃促使蔗糖代谢相关酶基因表达上调，且随着干旱的加剧上调水平越明显。