甜柿炭疽病病原菌的鉴定及其防治药剂的筛选

张 童, 姚立萍, 胡玉慈, 唐鑫彪, 何淑敏, 陈清西, 文志丰

(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2.福州市农业科学研究所，福建 福州 350018；3.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)

柿(Diospyroskaki)是柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros)的一种温带经济林树种.我国是柿的原产国，拥有世界上最悠久的柿树栽培历史，种植面积和柿果产量居世界之首[1- 2].柿具有较高的营养保健价值，果实中富含多酚、维生素等营养成分，具有清热、润肺、止血、降压等功效.近年来，柿树病害日益严重，主要有褐斑病、角斑病、黑斑病，炭疽病等[3-4].其中，柿炭疽病可危害叶、梢、花和果实等部位，导致树势衰弱、叶片干枯脱落、枝梢腐朽折断、花腐、果腐，成为柿产业持续健康发展的限制因子[5].

目前已报道能侵染柿树的炭疽菌种有尖孢炭疽复合种(theColletotrichumacutatumspecies complex)中的尖孢炭疽菌(C.acutatum)[6],胶孢炭疽复合种(theC.gloeosporioidesspecies complex)中的胶胞炭疽菌(C.gloeosporioides)、哈锐炭疽菌(C.horii)和暹罗炭疽菌(C.siamense)[7]，以及博宁炭疽复合种(TheC.boninensespecies complex)中的喀斯特炭疽菌(C.karstii)[8].Jeon et al[9]利用ITS、ACT、GADPH基因序列鉴定出哈锐炭疽菌为韩国柿炭疽病的致病菌；张敬泽等[10]揭示了柿炭疽病菌侵染过程中分生孢子的超微结构及分生孢子从萌发到附着孢形成的过程；曲健禄等[11]测定了柿炭疽病菌胶孢炭疽菌的生物学特性以及7种杀菌剂对该菌的毒力作用；Lim et al[12]报道腈菌唑和戊唑醇可有效抑制柿炭疽病；Gang et al[13]测定了5种田间防治甜柿炭疽病常用药剂的EC50值.但有关柿炭疽病菌分离鉴定及防治药剂筛选的报道仍较少.

福建农林大学果树抗病与遗传育种课题组在福建省莆田市仙游县游洋镇柿种植园调研时发现‘富有’甜柿叶片上出现大量不规则坏死斑，疑似炭疽病，严重影响甜柿的正常生长发育，给当地甜柿产业造成巨大的经济和生态损失.本研究通过病样采集、病原菌分离纯化、形态学观察、分子学分析及致病性检测，确定引起该地区甜柿炭疽病的病原菌，并通过室内毒力试验测定6种田间常用药剂对该病菌的抑制效果，以期为甜柿炭疽病的综合防控提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 样品采集及供试药剂

于2018年10月17日从福建省莆田市仙游县游洋镇柿种植园采集患有疑似炭疽病的‘富有’甜柿叶片，观察并记录发病症状.

抑菌试验所用的药剂(表1)均购自市场.

表1 试验所用6种药剂

1.2 病原菌的分离纯化

参照方中达[14]的方法进行病原菌的分离纯化.选取发病叶片，无菌水清洗表面灰尘，在病斑与未发病交界处剪取6 mm×6 mm的矩形组织块，在75%酒精中浸泡1 min，无菌水中漂洗1 min，接着在2%次氯酸钠溶液中浸泡1 min，无菌水中漂洗1 min，然后用无菌滤纸吸干表面水分，置于PDA培养基中，28 ℃、12 h光照/12 h黑暗条件下恒温培养.待组织块在培养基上长出菌丝后，用无菌接种针挑取菌丝进行分离培养，待其长出分生孢子后采用直接挑取法进行单孢纯化，获得的纯菌株置于4 ℃冰箱保存备用.

1.3 病原菌的形态学鉴定

菌株在PDA培养基上28 ℃恒温培养7 d后，用已灭菌的打孔器在菌落边缘打取直径6 mm的菌饼，接种到新的PDA培养基中央，28 ℃恒温培养，每株菌株做3次重复，7 d后观察菌落颜色和形态，并测量菌落直径，计算菌丝平均生长速率(mm·d-1).在倒置荧光显微镜(LEICADMI8)下观察分生孢子形态，并随机测量100个分生孢子大小.

1.4 病原菌的多基因分子分析与鉴定

将已纯化的菌株接种到新的PDA培养基中，待菌丝长满培养基，刮取适量菌丝体，利用真菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取病原菌基因组DNA，-20 ℃保存.用胶胞炭疽菌特异性引物(CgInt/ITS4)[15]、尖孢炭疽菌特异性引物(CaInt2/ITS4)[16]、核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spaces, ITS)引物(ITS1/ITS4)、β-微管蛋白(β-tublin gene, TUB2)引物(Bt2a/Bt2b)、钙调蛋白(calmodulin gene, CAL)引物(CL1C/CL2C)和肌动蛋白(actin gene, ACT)引物(ACT-512F/ACT-783R)进行PCR扩增[17-18].PCR反应体系为25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL.PCR扩增程序：94 ℃预变性90 s；94 ℃变性30 s，退火30 s(不同引物的退火温度见表2)，72 ℃延伸1 min，共36个循环；72 ℃延伸10 min.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶纯化试剂盒回收目的条带，送至铂尚生物技术(福州)有限公司测序.

表2 扩增甜柿炭疽病病原菌不同序列所用的引物

病原菌多基因序列分析及系统发育树构建：参考文献[18-22]从NCBI的GenBank数据库中下载模式菌株及已发表的菌株序列(表3)，利用ClustalX 1.81软件处理4个保守基因ITS、TUB2、CAL和ACT序列组合数据，通过软件MEGA 7.0将序列信息按ITS-TUB2-CAL-ACT的顺序分别首尾相连，以最大简约法构建菌株的多基因系统发育树，并利用自展法(bootstrap)进行检测，共循环1 000次.

表3 本研究中所用菌株的信息1)

1.5 病原菌致病性测定

将保存在4 ℃的菌株活化后转接到新的PDA培养基中，28 ℃培养长至PDA培养皿的4/5左右，用已灭菌的打孔器打取直径6 mm的菌饼和空白PDA培养基圆片.采用针刺法进行回接试验：选取无病斑、无损伤的甜柿叶片，经75%酒精消毒后，用无菌接种针轻刺叶片，将菌饼贴于叶片伤口处，以接种空PDA培养基圆片的叶片为对照.将离体回接后的叶片平铺于保鲜盒中，28 ℃、80%湿度条件下培养7～10 d，观察并记录叶片发病症状.再次对甜柿叶片发病部位的病原菌进行分离纯化，并比较其与原接种菌株的形态特征.

1.6 病原菌防治药剂室内筛选

1.6.1 菌丝生长抑制试验 无菌条件下，将6种供试药剂用无菌水配制成有效成分含量为10 000 mg·L-1的母液，吸取适量母液并用液体PDA稀释至田间推荐使用浓度，配制成含药PDA培养基.供试菌株培养7 d后，用已灭菌的打孔器打取直径6 mm的菌饼，将菌饼接种于含不同药剂的PDA培养基中央，以不含药剂的PDA培养基为对照，每种药剂做3次重复.28 ℃恒温培养7 d，每隔24 h观察、记录一次，至第7天采用十字交叉法测量各处理菌落直径，并根据以下公式计算各药剂的菌丝生长抑制率.

菌丝生长抑制率/%=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100

1.6.2 孢子萌发抑制试验 吸取浓度约为1.0×106个·mL-1的孢子悬浮液和供试药剂田间推荐使用浓度的2倍液各40 μL，充分混匀后滴于干净的单凹载玻片上，以无菌水为对照，28 ℃恒温黑暗培养8 h后在倒置荧光显微镜下观察、统计各处理分生孢子萌发情况.每个处理镜检200～300个孢子，每种药剂3次重复，根据以下公式计算孢子萌发抑制率.

孢子萌发抑制率/%=(对照孢子萌发数-处理孢子萌发数)/对照孢子萌发数×100

试验数据由 Microsoft Excel 2010、DPS数据处理平台进行统计分析.

1.7 部分供试药剂的室内毒力测定

选取抑菌效果好的4种药剂做进一步的毒力测定试验，每种药剂设置5个浓度(嘧菌酯:1 250、750、250、50、10 mg·L-1；波尔多液:2 400、1 200、600、300、150 mg·L-1；百菌清:1 600、800、400、200、100 mg·L-1；唑醚·代森联:2 500、1 250、625、250、125 mg·L-1)，制成含药PDA培养基.供试菌株培养7 d后，用已灭菌的打孔器打取直径6 mm的菌饼，接种于PDA培养基中央，菌丝面朝下，以不含药剂的PDA培养基为对照，每种浓度做3次重复，28 ℃恒温培养7 d，采用十字交叉法测量各处理菌落直径，计算菌丝生长抑制率.

通过Microsoft Excel 2010、DPS数据处理平台计算菌丝生长抑制率机率值与药剂浓度对数值之间的线性回归方程、各药剂对甜柿炭疽菌的有效抑制中浓度(EC50)，比较该病原菌对各药剂的敏感性.

2 结果与分析

2.1 田间症状

柿炭疽病发病期长，从新叶形成一直持续到柿果采收.叶尖或叶缘处先发病，叶片正面出现褐色圆形或不规则形坏死斑(图1A-B)，严重时连成片，造成叶片萎蔫干枯甚至脱落；叶片背面出现黑褐色点状坏死斑(图1C).

2.2 病原菌形态

本研究共分离获得5株纯化菌株，依次编号为FJXYTS-1、FJXYTS-2、FJXYTS-3、FJXYTS-4、FJXYTS-5. 5株菌株在PDA培养基上的菌落颜色、形态及菌丝生长速率无明显差异：菌落近圆形，气生菌丝绒毛状，初期为白色，28 ℃、12 h光照/12 h黑暗恒温培养7 d后，逐渐变为轮纹状、灰褐色(图1D)；菌落背面有少量黑色素沉积，呈现不均匀的灰白色至灰褐色(图1E)；菌丝生长速度较快，平均生长速率为11.6 mm·d-1.分生孢子圆柱形或长椭圆形，无色，单孢，两端钝圆或一端钝圆略粗，另一端稍尖(图1F)；少量分生孢子含1～2个油球(图1G)，大小为(9.5～11.2) μm×(4.7～5.2) μm；分生孢子萌发时，一端细胞伸出芽管(图1H)，芽管长度超过分生孢子直径.

2.3 病原菌的多基因分子分析与鉴定

利用胶胞炭疽菌特异性引物(CgInt/ITS4)从5株供试菌株基因组DNA中均扩增出一条约500 bp的条带(图2A)，而利用尖孢炭疽菌特异性引物(CaInt2/ITS4)都未扩增出任何条带(图2B).进一步利用ITS、TUB2、CAL和ACT引物对5株菌株进行PCR扩增，都扩增出单一条带(图2C-F).测序结果显示：从5株菌株中扩增所得到的序列一致，结合形态学特征确定这5株菌株为同一种病原菌.将所得序列信息提交至GenBank数据库，获得登录号:ITS为MN262115，TUB2为MN262118，CAL为MN262117，ACT为MN262116.

通过MEGA 7.0构建ITS-TUB2-CAL-ACT多基因系统发育树(图3)，可以看出，供试菌株与已登录的C.fructicola(ICMP18163)聚为一个分支，支持率为98%.结合形态学特征，将供试菌株鉴定为胶孢炭疽复合种中的果生刺盘孢(C.fructicola).

2.4 病原菌致病性

甜柿叶片在室内接种分离菌株3 d后开始表现出发病症状，接种部位出现褐色点状病斑，接种5 d后病斑逐渐扩大为近圆形或不规则形，接种7 d后病斑进一步扩大，且颜色变为黑褐色(图4B)，与田间症状相似；而对照组未发病(图4A).对叶片发病部位的病菌进行分离纯化，所得菌株菌落颜色及分生孢子形态大小与原接种的菌株无明显差异，符合柯赫氏法则，由此确定果生刺盘孢为甜柿炭疽病的致病菌.

2.5 病原菌防治药剂筛选结果

除50%多菌灵外，其他5种供试药剂对果生刺盘孢菌丝生长均表现出不同程度的抑制作用(图5).其中，75%百菌清1 000倍液对该菌菌丝生长的抑制作用最强，抑制率达71.64%(图5G，表4)；60%唑醚·代森联1 000倍液和25%嘧菌酯1 000倍液的抑制效果次之，抑制率分别为67.98%和63.30%(图5F、5E，表4)；50%多菌灵1 000倍液的抑制效果最差，抑制率仅为0.27%，与清水对照无显著差异(图5B，表4).6种药剂对果生刺盘孢分生孢子萌发的抑制效果均与对照差异显著.其中，抑制效果较好的药剂为75%百菌清和25%嘧菌酯，抑制率分别达85.69%和84.49%； 70%甲基硫菌灵对分生孢子萌发的抑制率最低(表4).综上所述，抑制果生刺盘孢菌丝生长和孢子萌发的最佳药剂为75%百菌清，可用于田间甜柿炭疽病的防控试验.

表4 6种供试药剂对果生刺盘孢菌丝生长与分生孢子萌发的抑制率1)

2.6 部分供试药剂的室内毒力

4种药剂中，75%百菌清对果生刺盘孢的毒力最强，EC50值为27.44 mg·L-1；60%唑醚·代森联和25%嘧菌酯毒力居中，EC50值分别为29.13和44.68 mg·L-1；80%波尔多液的毒力最差(表5).

表5 4种供试药剂对果生刺盘孢的室内毒力

3 讨论

炭疽菌属真菌是一类分布广泛的植物病原菌类群，其形态学鉴定主要依据菌落形态、菌丝生长速率、分生孢子及附着孢的形态与大小.由于该属真菌种类繁多，其形态特征易受培养条件影响而发生变异，不易进行种间鉴定[23].目前，炭疽菌鉴定多采用形态学观察结合多基因系统分析的方法，Hassan et al[24]采用形态学结合ITS、ACT、GADPH等基因序列对韩国甜柿上的炭疽病菌进行研究，鉴定出哈锐炭疽菌和暹罗炭疽菌.本研究通过形态学观察、构建多基因(ITS、TUB2、CAL、ACT)系统发育树及致病性测定，将分离到的菌株鉴定为胶孢炭疽复合种中的果生刺盘孢(C.fructicola)，这是该菌侵染甜柿的首次报道.果生刺盘孢地理分布广泛，寄主种类繁多，包括泰国的咖啡属(Coffea)植物、德国的榕属(Ficus)植物、日本的沙梨(Pyruspyrifolia)、美国的苹果(Malusdomestica)和草莓(Fragaria×ananassa)及巴西的苹果，还有茶树(Camelliasinensis)、油茶(Camelliaoleifera)、芒果(Mangiferaindica)和辣椒(Capsicumannuum)等经济作物[25-28].

目前已有很多关于柿炭疽病防治药剂筛选的报道.本次室内毒力试验结果显示：百菌清对果生刺盘孢的防治效果最好，唑醚·代森联和嘧菌酯防治效果次之，甲基硫菌灵和多菌灵几乎无防治作用.这与余贤美等[29]报道柿树炭疽菌对多菌灵敏感性低的结论一致.本试验中的药剂筛选是在室内进行，而室内环境与田间环境存在较大差异，所以在推广应用之前，还需进一步开展田间药效试验.