半枝莲多倍体抗性生理指标研究

岳 敏，杨树国，陈 敬，张京刚，郭承沫

（1 新泰太平山省级自然保护区管理处，山东新泰 271200；2 新泰市国有太平山林场）

半枝莲（Scutellaria barbata D.Don.）为唇形科黄芩属植物，是多年生草本药用植物，全草入药，具有解热、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒和抗氧化等药用价值。

多倍体药用植物一般具有根、茎、叶和花果的巨型性，抗逆性强，药用成分含量高等特性[1]，这正是药材优质、高产育种所期望达到的目标。目前，利用多倍体诱导的方法已经在许多药用植物中取得了良好的效果。半枝莲多倍体的研究已见相关报道，以半枝莲茎段、茎尖为材料，分别采用诱导剂氨磺灵和秋水仙素离体诱导，获得半枝莲多倍体植株[2-3]。多倍体植物由于其倍性水平的改变，对逆境的适应性和抵抗能力可能会发生相应的变化，与其生理代谢的变化相关。植物体内一些酶及可溶性糖等物质与生长和抗逆性相关，这些生理指标常用于评价植物抗逆性强弱。常用的生理指标有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）及可溶性糖的含量。

药用植物半枝莲多倍体抗逆性如何目前未见相关报道。本研究以3个株系多倍体半枝莲和二倍体半枝莲植株为材料，通过测定SOD、CAT、MDA及可溶性糖的含量，研究多倍体半枝莲植株抗逆性的强弱，探索药用植物半枝莲倍性育种的应用前景，为药用植物的多倍体诱导提供理论支持，以期培育具有药用成分含量高、抗逆性强、适应地域广的药用半枝莲新品种。

1 材料

1.1 材料

半枝莲种子（购于亳州中药材市场）经萌发获得植株。经体细胞染色体鉴定为二倍体2n=2x=26。组培苗及多倍体株系获得参考氨磺灵离体诱导半枝莲多倍体研究[2]。于4月将根系完整、长势好而整齐的半枝莲多倍体和二倍体组培苗取出用自来水冲洗根部，将培养基残留物冲洗干净，然后转入灭过菌的花盆土壤中，浇足够的水，并在花盆外面套上塑料袋，在培养室内培养。培养条件为：温度（25±1）℃，湿度70%～80%，光周期为16 h/d，光照强度为60μmol/（m2·s）。每隔2天浇1次水，移栽10天后将塑料袋打开以适应外界环境，培养2个月。

1.2 生化试剂

0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液；750μmol/L氮蓝四唑溶液；100μmol/L EDTA-Na2溶液；20μmol/L核黄素溶液；磷酸缓冲液60mmol/L pH7.4；32.4 mmol/L钼酸铵溶液；基质液；10%三氯乙酸；0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液。

2 方法

2.1 SOD、CAT含量的测定

取一定部位的植物叶片0.5g于预冷的研钵中，加1mL预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为9mL。10000r/min下离心20min，上清液即为SOD、CAT粗酶提液。

SOD含量的测定采用氮蓝四唑（NBT）法参照李合生[4]的方法。SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位U/g·Fw。

CAT含量的测定采用钼酸盐法参照Nakano&Asada[5]的方法，其活性单位定义为：每克植物材料每秒钟分解的CAT量为一个活力单位，U/g Fw。

2.2 MDA、可溶性糖含量的测定

取一定部位的植物叶片0.5g于预冷的研钵中，加入少量石英砂和10%三氯乙酸2mL，研磨至匀浆，再加6mL 10%三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min，其上清液为丙二醛、可溶性糖提取液。

MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法参照Heath&Parker[6]的方法。

可溶性糖含量的测定参照李合生[4]的方法。

2.3 统计分析

用SPSS13.0统计软件对相关数据进行方差分析。方差分析采用最小显著差异法（LSD）进行多重比较。表中数据后面的大写字母表示P＜0.01水平，小写字母表示P＜0.05水平，相同字母表示差异不显著。

3 结果与分析

3.1 SOD、CAT含量的测定

SOD、CAT在植物体内普遍存在。SOD是一种消除超氧阴离子自由基的酶，CAT活性与植物的代谢强度及抗病、抗寒能力有关。本研究主要测定并比较了3个株系多倍体与二倍体叶片中SOD、CAT的活性，测定结果。由表1可知，相同栽培条件下，3个株系多倍体半枝莲SOD、CAT活性与对照二倍体植株有显著性差异，其中多倍体株系1、2、3 SOD活性较二倍体半枝莲分别高出40.1%、44.3%、44.7%，CAT活性较二倍体半枝莲分别高出8.5%、12.6%、16.8%。多倍体半枝莲较二倍体半枝莲清除体内的过氧化物能力强，可更好地抵御衰老、疾病等不良环境的影响。

表1 多倍体与二倍体半枝莲SOD、CAT生理指标

3.2 MDA、可溶性糖含量的测定

MDA含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系，间接反映了细胞受损伤的程度，可溶性糖是植物的主要渗透调节物质，在细胞内起保护酶类的作用。本研究主要测定并比较了3个株系多倍体与二倍体叶片中MDA、可溶性糖的含量，测定结果见表2。

通常利用MDA作为脂质过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱，可溶性糖是细胞内主要的渗透调节物质。多倍体较高的抗氧化酶活性使MDA含量维持在较低的水平。由表2可知，相同栽培条件下，3个株系多倍体半枝莲MDA较二倍体植株显著降低，其中株系3降低最多，MDA较二倍体株系低47.6%，3个株系多倍体半枝莲可溶性糖较对照降低，其中株系3可溶性糖低29.5%，株系1与对照无显著性差异。这表明多倍体半枝莲较二倍体半枝莲可能具有更强的抗逆性。人工加倍获得的多倍体半枝莲植株可能比其二倍体具有更强的生长优势。

表2 多倍体与二倍体半枝莲MDA、可溶性糖生理指标

4 讨论与结论

大量研究表明，多倍体植株由于染色体加倍，使得体内一些酶及一些可溶性糖的含量有所增加，这些生理指标常用于评价植物抗逆性强弱。如四倍体蒲公英与二倍体相比SOD平均增加29%，CAT平均增加40%[7]；四倍体大蒜SOD、POD、CAT活性、可溶性蛋白含量均高于二倍体[8]。植物多倍化过程是引发基因表达状况改变的一个重要方式，在此过程中的染色体重排、基因分化和重复基因组的表达使基因表达的直接产物——酶发生变化。

本研究发现，多倍体半枝莲SOD、CAT较二倍体植株显著提高，SOD活性较二倍体半枝莲高出44.7%，CAT活性较二倍体半枝莲高出16.8%。说明多倍体清除体内的过氧化物能力强，可更好地维持其体内正常的活性氧水平，更好地抵御衰老、疾病等不良环境的影响。多倍体较高的抗氧化酶活性使MDA含量维持在较低的水平，多倍体半枝莲MDA的含量较二倍体植株显著降低，株系3半枝莲MDA较二倍体株系低47.6%。相同栽培条件下，多倍体半枝莲可溶性糖含量较二倍体降低，株系2、3可溶性糖分别降低20%和29.5%与对照二倍体有显著性差异，株系1可溶性糖降低6.5%与对照无显著性差异，这可能与植物本身基因型及生理年龄发育阶段有关。多倍体与对照二倍体植株可溶性糖含量的不同表明，相同栽培条件下，多倍体植株具有更强的适应逆境的能力。这表明半枝莲倍性水平的改变对其植株抗性相关生理指标SOD、CAT、MDA及可溶性糖含量变化具有直接的影响。多倍体半枝莲植株与二倍体植株相比抗逆性更强。由此可以推断，人工加倍获得的多倍体半枝莲植株可能比其二倍体具有更强的生长优势和抗逆性。

多倍体植物生长和抗逆性的优势可能是由于染色体加倍所致。一般认为植物营养器官性状的变化与基因的剂量有关，即随着基因拷贝数的增加，基因转录产物的量发生变化，导致性状出现相应的变化，但不一定存在直线关系[9]。

多倍体半枝莲在各项与抗性相关的生理指标SOD、CAT、MDA及可溶性糖含量上具有显著的优势，表明多倍体半枝莲植株与二倍体相比已经具有了较好的抗逆性物质基础，可作为进一步培育药用半枝莲新品种良好育种材料。但是，多倍体半枝莲的这些优势在各类逆境胁迫条件下是否能够真正体现，还需要更深入地研究，同时还需进一步研究半枝莲多倍体植株抗逆性增强的分子机制。