内置式双向电极观察先天性巨结肠动物模型肠电图

李霁伟，谢余澄

（昆明市儿童医院病理科，云南昆明 650228）

无神经节细胞性巨结肠病（hirschsprung’s disease，HD），是一种严重危害婴幼儿健康的先天性消化道畸形[1]。主要病理变化是一段结肠壁内缺乏神经节细胞，从而无法诱导该段结肠神经动作电位无法形成和传导，致使肠道持续性痉挛，肠腔狭窄，内容物储留，继发性肠炎等一系列严重消化道症状[2]。基础研究已经表明，胃肠道拥有多个起搏点均能自主发放节律性慢波，延胃肠道平滑肌向远端传播。本研究在改良的HD 动物模型基础上，采用自主研发的肠道内置式双向电极，观测和接收HD 模型乳鼠不同肠道内电生理及肠电图改变，并与组织病理学检查诊断对比分析，探讨内置式双向电极在HD 诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF 级SD 大鼠60 只，2 月龄，体重（220±10）g，雌雄各半，购自于昆明医科大学动物实验室，并委托饲养至性成熟后繁殖的4～5 日龄乳鼠80 只。

1.1.2 试剂 PHOX2B 兔抗人多克隆抗体ImmunoWay Biotechnology Company。

1.1.3 仪器 电刺激仪（model A310）及电隔离仪（Stimulus Isolator，model A365）美 国 World Precision Instruments，Inc（Sarasota，Florida）；生物信号采集处理系统（MedLab－U/8c502）中国南京美易科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HD 动物大鼠模型的建立和分组 新生4～5 日龄SD 乳鼠40 只为实验组，乙醚麻醉，在无菌条件下腹部正中切口提出乙状结肠，将0.5%BAC溶液浸泡过滤纸条（1.5 cm×1 cm）紧贴肠壁环形包绕结肠1 周，每5 min 滴加50 μL 的0.5%BAC溶液于滤纸上，保持滤纸湿润。60 min 后移去滤纸条，清洁腹腔，还纳肠管，关闭腹腔，注射用青霉素钠粉剂涂切口。对照组40 只，手术方式同实验组，用生理盐水代替0.5%BAC 溶液，作用时间及计量同实验组。术后第1 周实验组开始出现腹胀，至术后第2 周实验组均出现不同程度的排便减少，腹胀，精神萎靡，消瘦，粪便颗粒比对照组干燥且明显变小，处死后大体解剖可见BAC 处理结肠段肠管狭窄痉挛，无蠕动，病变近端肠管扩张，肠腔内容物潴留。

1.2.2 常规HE 染色观察神经节细胞 病理常规HE 染色操作步骤，HD 模型乳鼠肠道组织标本切片显色，观察着色后神经节细胞在肠道的正常段、移行段和狭窄段的分布和数量。

1.2.3 免疫组织化学PHOX2B 抗体在神经节细胞中的特异表达 S-P 免疫组织化学方法操作步骤，PHOX2B 抗体在HD 模型乳鼠肠道组织标本切片上显色，观察PHOX2B 着色后神经节细胞在肠道的正常段、移行段和狭窄段的分布和数量。

1.2.4 肠道电生理检测 经肛门将三对固定在肠道中空球囊上的环状电极放于HD 实验组病变肠道的正常段、移行段和狭窄段内，电极间间距为0.5 cm。而对照组乳鼠，环状电极放入直肠内距肛门外缘2 cm。通过生物信号采集处理系统（MedLab－U/8c502）分别记录正常段、移行段和狭窄段肠道传导电信号。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件对收集的数据进行统计学处理。定量资料服从正态分布的用（）描述，不服从正态分布的用P50（P25，P75）描述，进行正态性检验和方差齐性检验，满足正态性及方差齐性的多组间比较采用单因素方差分析；不满足正态性或方差齐性的定量资料，组间比较采用Kruskal Wallis H 检验。如果多组建比较有差异，采用Bonferroni 法进行两两比较。两个定量变量的相关性分析，对不符合正态分布的定量资料，采用Spearman 秩相关系数（rs）。检验水准为双侧α=0.05，以P＜0.05 为差异有统计学意义。组间两两比较检验水准调整为双侧α=0.0167，即P＜0.0167 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HD 幼鼠模型鉴定

分别取对照组乙状结肠正常段，实验组乙状结肠狭窄段和移行段，做病理常规HE 染色，观察肠壁肌间神经丛内神经节细胞形态（图1A-C），计数正常段、移行段和狭窄段神经节细胞数量（表1），其中正常段与移行段的细胞数量不服从正态分布，分别为5（4，6），1（1，2），正常段细胞数量多于移行段（H=39.70，P＜0.001）与狭窄段（H=79.85，P＜0.001），移行段细胞数量多于狭窄段（H=40.15，P＜0.001），证实成功构建HD 乳鼠实验动物模型。

图1 不同阶段肠道神经节细胞形态（HE×400）Fig.1 Morphology of intestinal ganglion cells in different segments（HE×400）

表1 HE 染色肌间神经节细胞数量[P50（P25，P75）]Tab.1 The number of intramuscular ganglion cells stained by HE[P50 （P25，P75）]

2.2 PHOX2B 抗体特异性表达

显微镜下观察PHOX2B 抗体着色于神经节细胞的胞浆与胞核（图2，A-C），计数正常段、移行段和狭窄段神经节细胞数量（表2），分别为5.20±0.88，2.03±0.73，0，正常段细胞数量多于移行段（H=40.00，P＜0.001）与狭窄段（H=80.00，P＜0.001），移行段细胞数量多于狭窄段（H=40.00，P＜0.001），证实成功构建HD 乳鼠实验动物模型，并且PHOX2B 抗体着色下神经节细胞数量与HE 染色观察数量相符。

2.3 不同阶段肠道电生理测定

经肠道内置双向电极引导和MEDLAB 生物信号采集系统显示正常段、移行段和狭窄段肠道肠电图电信号（图3，A-C），记录各段生物电信号强弱（表3），分别为76.94±9.06，15.40±5.03，2.5（1.8，3.7），正常段肠道电压高于移行段（H=41.08，P＜0.001）与狭窄段（H=78.93，P＜0.001），移行段肠道电压高于狭窄段（H=37.85，P＜0.001）。

图3 不同节段肠道的肠电图形态和强度Fig.3 Morphology and intensity of electroenterogram in different segments of intestinal tract

表3 肠电图不同节段电压[（）或P50（P25，P75）]Tab.3 The voltage of different segments in electrointestinogram[（）或P50（P25，P75）]

表3 肠电图不同节段电压[（）或P50（P25，P75）]Tab.3 The voltage of different segments in electrointestinogram[（）或P50（P25，P75）]

与狭窄段肠管比较，△P＜0.001；与移行段肠管比较，▲P ＜0.001。

2.4 神经节数量与电压幅度相关性分析

不论HE 染色，还是PHOX2B 染色观察下，神经节细胞数量与肠道电压强度存在正相关，即细胞数量越多，接收电压越大（rs=0.903，P＜0.001；rs=0.907，P＜0.001），见表4。

表4 神经节细胞数量与接收电压的相关性分析Tab.4 Correlation analysis of ganglion cell number and intestinal voltage

3 讨论

HD 作为婴幼儿先天性消化道畸形之一，其发病率在1:2 000～5 000，我国约为1:2 500，平均男与女之比为4:1，新生儿发病率逐年攀升[3]。多年来对HD 的诊断完全依赖于常规病理，尽管诊断方式不断更新，从最初的常规HE、免疫组织化学染色、冰冻到乙酰胆碱酯酶观测，再到基因学筛查，然而对HD 的误诊率依然较高[4-6]。此外，还缺乏动态的、连续性的、广泛及直观的对HD 和肠道神经节细胞的有效监测手段。

胃肠道电生理学的发展，为研究和探索消化道机能开辟了一条新的途径。早在1922 年，Alvarez首次报道从人体表记录到胃电活动[7]。1957 年，Davis 等叙述了经皮肤电极从腹部记录胃电活动的技术，并且深入探讨了呼吸、运动伪迹、心电等信号对胃电的干扰，以及食物、休息、视觉刺激等因素对胃电图的影响[8-9]。此后，于1959 年Tiemann F和 Reichertz P[10]正式提出“ 胃电图 "（electrogastrogram，EGG）以及肠电图（electrointestinogram，EIG）的名称。1983 年，美国心理生理学会以“胃电图及其意义”为专题，编辑出版了名为《胃电图及其临床应用》的专著[11]，系统性的介绍了胃电图的原理、方法、发展历史和新近的研究成果。1993 年，国际胃电图学术会议在波士顿举行，主旨介绍了胃电图信号的获取和分析、数学模型及仪器的微型化[12]。1999 年厦门的胃电图学术会议制定了我国的胃电图诊断标准（草案）[13]，目前对于胃电图的检测及研究工作不断发展，动态胃电图仪的推出也使得这一检测方法日趋成熟[14]。然而，国内外对儿童消化道运动与胃肠电图的关系、节律紊乱等研究较少，进展缓慢，其中专门针对HD 的研究和动物模型建立更为少见[15-17]。

回顾过去研究，儿童消化道疾病问题是基于成人胃肠电图研究的总结，依然停留在体表引导电信号而非直接体内引导及动态观察，也并没有从病理诊断HD 标准角度来考虑病因与肠电图之间的关系。因此，基于消化道解剖结构开放性的特点，笔者改良并建立了HD 乳鼠实验动物模型，并采用肠道内置式双向电极观察，发现正常段、移行段和狭窄段肠壁引导出的肠电图电信号强度有差异，特别是正常段与狭窄段差异显著（P＜0.001）。同时，HD 模型组幼鼠伴发有排便次数减少、便细、腹胀等一系列临床症状。而经HE 和PHOX2B 抗体染色证实，移行段内神经节细胞数量明显减少，细胞发育幼稚，胞浆稀少，核仁不明显，特别是狭窄段内神经节细胞消失，仅见增生粗大的神经丛。肠电图电信号强弱与神经节细胞的数量、形态及分布呈正相关（P＜0.05），即神经节细胞数量越少，电压强度越小；反之，电压强度越大，神经节数量越接近正常肠道。特别重要的是狭窄段电信号极弱，无法形成能有效观察的肠电图，这一特点将是笔者研究肠电图信号为诊断HD 提供的重要参考依据。此外，内置式设计能较为持续和动态的观察到了肠道内的变化，在免除有创性标本采样的同时，降低了手术风险和术后并发症，大幅度提高了幼鼠生存率。

本研究在前期工作的基础之上证实了神经节细胞数量与电信号强弱的相关性，希望为临床提供一种行之有效的、无创性的诊断HD 途径。而本实验还存在有异位电信号干扰，选择更为合理的动物建立模型及HD 病因机制不清等诸多不足，待进一步深入研究。