hTERC 基因检测与HC2、SPR 技术检测HPV在宫颈病变中的诊断价值

廖 婧，许长俊，孙春意，潘 景，周红林，刘 洋

（1）昆明医科大学第二附属医院妇科，云南昆明 650101；2）玉溪市人民医院生殖医学科，云南玉溪653100，3）昆明医科大学第二附属医院生殖医学科，云南昆明 650101）

宫颈癌（cervical cancer，CC）是女性患者发病率较高的生殖道恶性肿瘤之一，据统计，2018年全世界CC 发病率为3.2%[1]，我国发病率也高达3.6%[2]，严重损害全球妇女的身心健康，其主要由高危人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持续感染引起[3]。但绝非所有的HPV 感染都可进展至癌前病变及宫颈癌，据统计有超过一半的HPV感染患者可通过自身免疫清除感染，CC 发病率要显著低于HPV 感染率，因此推测还有其他因素参与共同导致CC 发生[4]。现很多国内外学者[5-6]发现，在各级宫颈病变中几乎都伴有人端粒酶基因（human telomerase componentgene，hTERC）的过度表达，表明其在宫颈恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥关键作用，可作为宫颈病变明确诊断和评估预后的标志物。

本研究分别采用杂交捕获II（hybrid captureⅡ，HC2）和等离子谐振法（surface plasmon resonance SPR）检测HPV 感染情况，同时用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）法来获取不同宫颈组织中hTERC 基因的表达情况，从而探讨宫颈病变初期普通筛查中hTERC 基因与高风险类型HPV 感染的关系，为CC 早期诊断、治疗提供良好决策。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究已通过医院伦理审查委员会审查。研究对象为1 200 名于昆明医科大学附属第二医院妇科就诊且行宫颈筛查的患者，所有患者均为有性生活史且排除妊娠，无宫颈治疗史、放化疗史及严重内科疾病。所有标本均进行SPR-HPV、HC2-HPV 及hTERC 基因三项检测，其中一项结果提示为阳性的患者行阴道镜检查下宫颈活检，以病理学结果作为分组标准，有150 名患者行病理组织检查，将其分为4 组，即正常组32 例，CINI组38 例，CIN II-CIN III 组66 例，宫颈癌组14例。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集及实验步骤 将细胞采集刷、HPV 采样刷先后放入宫颈口，单向旋转3～5 圈后取出，把刷头置于保存液内，标记后送检。HC2技术的主要步骤：细胞的裂解、细胞的杂交、捕获、信号的扩大及信号的检测。SPR 技术的主要步骤：DNA 提取纯化、PCR 扩增、扩增产物基因型检测。FISH 检测：主要参照相关操作指南进行，包括：制作玻璃载片、预处理及标本变性杂交、制备玻片的洗涤及复染。

1.2.2 结果判读 如果含有3 个及以上红色信号的细胞核在100 个信号完整细胞核中的百分比超过规定阈值（本研究阈值为6.2%），则归类为hTERC 基因阳性，表示基因有扩增。HC2-HPV 技术属于半定量检测，若HR-HPV 负荷量≥1.0pg/mL 则为HC2-HPV 阳性。SPR-HPV 检测结果则由计算机自动解释。

1.3 统计学处理

实验数据用SPSS 软件包分析，计数资料采用例数及百分比表示，计量资料用χ2检验和秩相关性分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理学检测中hTERC 基因表达与宫颈病变的关系

宫颈病变级别不同，hTERC 基因表达情况存在显著差异（χ2=28.90，P=0.000），且随着宫颈病变程度的加重，hTERC 基因有扩增趋势，见表1。

2.2 hTERC 基因表达与HPV 感染的关联性

在正常组、CINⅠ、CINⅡ/CINⅢ、CC 组病变程度依次增加的情况下，hTERC 基因的异常扩增和HC2-HPV、SPR-HPV 的阳性率之间存在相关性联系（r1=0.538，P1=0.000；r2=0.796，P2=0.000），见表2，提示随着宫颈病变的升级，不仅有HPV 感染率的上升，hTERC 基因的表达率也在逐步增加。

表1 150 例患者hTERC 基因表达情况与病理分级Tab.1 hTERC gene expressions and pathological grades in 150 patients

表2 两种检测方法检测HPV 情况和hTERC 阳性表达的关系［n（%）］Tab.2 Relationship between HPV status and positive expression of hTERC detected by the two detection methods ［n（%）］

2.3 hTERC 基因在HC2-HPV、SPR-HPV 组别中的表达差异

在HC2-HPV 组中，hTERC 基因的扩增在HPV 感染和非感染组之间存在显著差异（P1=0.000）。同样的，hTERC 基因表达在SPR-HPV 感染组和非HPV 感染组之间也存在差异（P2=0.021），见表3。

表3 HC2-HPV 及SPR-HPV 组中hTERC 基因的表达情况［n（%）］Tab.3 Expressions of hTERC gene in HC2-HPV and SPR-HPV group ［n（%）］

3 讨论

CC 是迄今为止病因较为明确的一种妇科恶性肿瘤，现已明确高风险类型HPV 的持续感染与CC的发生有较强的关联性，据统计约90%的CC 患者均可发现HPV 感染[7]，因此，HPV 的检查对于筛检宫颈癌具有重大意义。本文提到的杂交捕获II技术（HC2-HPV）是FDA 唯一批准用于临床检测HPV 的手段[8]，但其缺点是无法实现HPV 准确的分型，无法指导临床去甄别高危型HPV 的类别，可造成患者不必要的心理和经济负担。而等离子谐振法（SPR-HPV）作为一种可鉴别16 种高危和8 种低危HPV 亚型的检测方法[9]，弥补了前者在HPV 分型上的短板，可帮助临床医生去甄别需要关注与治疗的HPV 感染患者，有助于了解各地区HPV 亚型的流行病学特点，对HPV 疫苗的研发与应用具有指导性意义，需要注意的是其特异度和阳性预测值不甚理想。故基于广泛性筛查和早期明确诊断的出发点来看，急需方便、快捷的生物学指标协同HPV 感染情况来综合性分析判断病情，使CC 的早期检出更精准，可信度更高。

端粒酶系维持人体基因组稳定性的一种核糖核蛋白酶，其在正常组织中表达较少，而在肿瘤组织中表达异常[10]。hTERC 基因作为其主要成分之一，通过增强端粒酶活性以使细胞得到永生，从而成为肿瘤发生的启动按钮。包括CC 在内的95%恶性肿瘤细胞中均可用荧光原位杂交法捕获到hTERC 基因的异常表达。本研究结果表明，hTERC 基因在各宫颈病变分组（从低至高）中的表达率分别为12.5%、34.21%、53.03%、85.71%，宫颈病变与该基因过度扩增有关，且该基因的扩增情况随着宫颈病变等级的增加而升高，与牛艳昕[11]的结论相一致，分析可能与该基因激活癌基因及促进侵袭分子产生相关。此外，有研究发现HPV 的感染与hTERC 基因的表达之间也存在关联性[12]，本研究结果显示随着病理学分组的升级，hTERC 基因的阳性表达率和HC2-HPV、SPR-HPV的阳性率均呈上升趋势，该基因与HPV 感染之间呈现正相关性，且HPV 阳性组别中hTERC 基因的表达要显著高于HPV 阴性组。以上均提示在宫颈病变中hTERC 基因的阳性表达与HPV 的感染密切相关，两者协同增强端粒酶活性，共同促进了宫颈病变的发生和发展[13]。因此hTERC 基因有望成为宫颈病变发展的预测指标。大量学者[14-15]提出，相比于单独检测hTERC 基因的诊断效能，该基因联合其他标志物（如HPV、C-myc、FOXM1 等）将会对宫颈癌的诊断更有意义。

综上，宫颈癌是一种发病率较高但发展缓慢的恶性肿瘤，早期的诊断和治疗显得尤其关键，除了应用广泛的HPV 检测技术，联合筛检hTERC基因可显著提高宫颈病变的检出率和准确率。随着对该基因的深入了解和探索，以该基因为靶点的治疗理念和药物在宫颈癌治疗前景上表现出极大优势[16-17]，相信hTERC基因今后将在包括宫颈癌在内的多种恶性肿瘤诊疗方面发挥更大的应用价值。