针刺调节炎性细胞因子改善大鼠脑梗死急性期脑血流的USPIO-DSC MRI研究

杨烁慧，吴瑜，詹松华，杨辰瑶，孔营楠，张成，陆方*

中风是世界范围内第五大常见的成人致死的病因，也是成人永久性致残最常见的原因之一。由脑血管斑块堵塞或血栓栓塞引起的缺血性中风约占所有中风的87%[1]。越来越多的证据表明，缺血性中风后炎性反应对于中风的进展和预后有重要影响[2]。已有研究证明针刺可以减轻缺血性中风后炎性反应[3]以及改善脑梗死区域微循环灌注[4-7]。超微超顺磁氧化铁微粒(ultrasmall superparamagnetic particles of iron oxides，USPIO)是一种血池性对比剂，其血浆半衰期长，磁敏感效应强，高剂量耐受性好，较钆喷酸葡胺盐(GDDTPA)更能准确反映梗死区域脑血流的灌注情况[8]，因此，笔者利用USPIO动态磁敏感增强(USPIO-dynamic susceptibility contrast，USPIO-DSC) MRI灌注扫描来探讨针刺通过调节大鼠脑梗死急性期血清炎性细胞因子的水平以达到改善脑梗死区域血流灌注的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验设计

本实验通过本院伦理和动物保护委员会备案和批准(SZY201712006)。清洁级健康成年雄性SD大鼠26只，体重规格为230～250 g (购于北京维通利华实验动物公司，在上海中医药大学实验动物中心饲养)。将大鼠随机分为三组，A组假手术组6只、B组无电针梗死组10只、C组电针梗死组10只，每组再根据时间节点24 h、48 h分为二个亚组，C组24 h和48 h亚组各有一只大鼠因造模失败而剔除出组，最终入组A组每个亚组各3只大鼠，B组每个亚组各5只大鼠，C组每个亚组4只大鼠。

1.2 模型制作

SD大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为0.35 ml/100 g。大鼠永久性大脑中动脉栓塞模型(permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO)的建立参照Longa线栓法[9]并且加以改良，其中A组线栓插入深度距离颈总动脉分叉约0.5 cm，B组和C组线栓插入深度距离颈总动脉分叉约1.6～2.0 cm，B组和C组大鼠造模麻醉苏醒后有相应转圈、侧倒或偏瘫视为造模成功。

1.3 针刺方法

C组大鼠穴位定位按照李忠仁等[10]制定的实验动物腧穴图谱，选取百会穴、右侧足三里穴和水沟穴，以医用华佗牌不锈钢28号1.5寸(1寸=3.33 cm)毫针快速刺入穴位，连接电针治疗仪(G6805-2，上海医疗器械高技术公司)。刺激参数为：疏密波4 Hz/20 Hz，脉冲宽度0.5 ms[11]。输出电压从1 V开始，每10 min增加1 V，最大为3 V，输出电流0.5 mA。造模完成待大鼠完全苏醒后执行第一次针刺，其后每间隔24 h电针一次，每次电针通电30 min，每日电针一次。A组大鼠在造模后不加任何处理，B组大鼠在C组大鼠电针的同时对其进行捆绑固定，不做针刺。

1.4 仪器和方法

所有检查均在1.5 T磁共振系统(UMR560；上海联影医疗技术有限公司，上海，中国)上完成，采用12通道相控阵腕关节线圈。MR扫描序列及参数：冠状位T1WI快速自旋回波序列(TR 450 ms，TE 12 ms，层厚2 mm，间距0.2 mm，FOV 80 mm×80 mm，矩阵100×192，NEX为4)、T2WI快速自旋回波序列(TR 3000 ms，TE 154 ms，层厚2 mm，间距0.2 mm，FOV 80 mm×80 mm，矩阵100×192，NEX为4)、DWI单次激发平面回波序列(TR 2500 ms，TE 94 ms，层厚3 mm，间距0.3 mm，FOV 100 mm×100 mm，矩阵100×96，NEX为5，b=0和1000 s/mm2)、T2*WI动态磁敏感加权序列(TR 1400 ms，TE 36 ms，层厚2 mm，间距0.2 mm，FOV 100 mm×100 mm，矩阵100×96，NEX为1)。T2*WI 动态磁敏感对比增强(susceptibilityweighted contrast-enhanced，DSC) MRI共扫描60个动态，前5个动态作为基线扫描，第6个动态开始，从大鼠尾静脉以0.1 mL/s团注6 mg Fe/kg[12]USPIO溶液(上海交通大学Med-X研究所提供)。

1.5 图像评价

所有模型鼠DSC MRI原始图像传至联影后处理工作站，原始图像经过运动伪影校正，去除背景噪声，动脉输入函数(arterial input function，AIF)选取等获得相对脑血流量(relative cerebral blood flow，rCBF)图，相对脑血容量(relative cerebral blood volume，rCBV)图。在A、B、C组每个大鼠各参数比值的测量过程中，先由2名具有10年以上神经MRI诊断经验的放射科医师翻阅DSC原始图像后共同协商出一个测量层面，再分别独立于B、C二组大鼠的该DSC原始图像上沿梗死区边缘勾画ROI，测量并记录rCBV，rCBF各参数值，再于对侧正常镜像区域画取同样大小的ROI并测量各参数值(图1)。A组在相同解剖部位于协商获得的层面上测量左右两侧各参数值。将测得的各参数值以梗死侧/正常侧(A组，右侧/左侧)得出各参数比值(rrCBV、rrCBF)后做进一步统计分析。每人分别进行2次测算获得数据，每次测量间隔一周，然后取平均值用于后续影像学检查。

1.6 病理检查

各亚组大鼠磁共振扫描结束后，打开腹腔，暴露腹主动脉，使用10 ml注射器进行取血，将全血放入离心管中，室温静置2 h后开始离心，离心机的设置为3000转/min，10 min，4℃，使用移液枪吸取上层血清，放入冻存管内，-80℃冰箱内保存，待实验结束后统一使用血清炎性细胞因子ELISA试剂盒检测，血清炎性细胞因子检测指标分别为IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 pMCAO大鼠USPIO-DSC各参数比值(rrCBV，rrCBF)

A组、B组和C组24 h和48 h各参数比值(rrCBV，rrCBF)见表1。24 h和48 h A、B、C 3组的rrCBV (24 h：χ2=9.035，P=0.011；48 h：χ2=8.909，P=0.012)和rrCBF (24 h：χ2=9.692，P=0.008；48 h：χ2=5.333，P=0.021)均显著不同。A组与B组比较，A组24 h亚组的rrCBV (Z=-2.236，P=0.025；)、rrCBF (Z=-2.236，P=0.025)均显著高于B组；48 h亚组的rrCBV (Z=-2.121，P=0.034)、rrCBF (Z=-2.121，P=0.034)亦均显著高于B组。A组与C组比较，A组24 h亚组的rrCBV (Z=-2.121，P=0.034)和rrCBF (Z=-2.121，P=0.034)均显著高于C组。48 h亚组的rrCBV (Z=-2.121，P=0.034)、rrCBF (Z=-2.121，P=0.034)亦均显著高C组。B组和C组比较，C组24 h亚组 rrCBV (Z=-2.205，P=0.027)和rrCBF (Z=-2.449，P=0.014) 显著高于B组；48 h亚组rrCBV和rrCBF均显著高于B组(Z=-2.309，P=0.021)(图1)。

2.2 pMCAO大鼠24 h和48 h血清炎性细胞因子分析

表1 T2*WI DSC序列pMCA_O大鼠rrCBV和rrCBF的平均值(±s)Tab. 1 Values of rrCBV and rrCBF mea_sured on T2*WI DSC images of pMCAO rats (±s)

表1 T2*WI DSC序列pMCA_O大鼠rrCBV和rrCBF的平均值(±s)Tab. 1 Values of rrCBV and rrCBF mea_sured on T2*WI DSC images of pMCAO rats (±s)

组别24 h48 h rrCBV A组0.98±0.040.99±0.03 B组0.42±0.090.40±0.04 C组0.63±0.130.74±0.17 rrCBF A组0.97±0.050.98±0.04 B组0.32±0.080.27±0.05 C组0.48±0.060.46±0.11

表2 pMCAO大鼠24 h及48 h血_清炎性细胞因子均值±标准差(±s)Tab. 2 Values of serum inflammatory cytok_ines detected on 24 h and 48 h of pMCAO rats (±s)

表2 pMCAO大鼠24 h及48 h血_清炎性细胞因子均值±标准差(±s)Tab. 2 Values of serum inflammatory cytok_ines detected on 24 h and 48 h of pMCAO rats (±s)

组别IL-1βIL-6IL-10TNF-α 24 h A组9.415±0.954 8.257±0.885 18.439±0.870 15.784±0.709 B组27.800±2.463 15.180±5.547 20.400±1.660 20.440±1.662 C组22.040±1.645 9.682±0.818 33.300±5.450 20.400±1.520 48 h A组 11.679±1.005 11.537±0.921 16.048±0.472 13.981±2.194 B组14.860±3.101 20.960±6.354 16.370±3.300 18.830±5.152 C组12.020±0.643 13.890±3.336 22.980±4.606 13.710±1.100

表3 B组+C组大鼠24 h rrCBV、rrCBF与各炎性细胞因子相关性Tab. 3 Correlations between values of rrCBV，rrCBF and inflammatory cytokines on 24 h of B plus C groups of rats

表4 B组+C组大鼠48 h rrCBV、rrCBF与各炎性细胞因子相关性Tab. 4 Correlations between values of rrCBV，rrCBF and inflammatory cytokines on 48 h of B plus C groups of rats

表5 pMCAO大鼠24 h和48 h rrCBV、rrCBF观察者间一致性检验Tab. 5 The inter-observer agreement test of rrCBV、rrCBF on 24 h and 48 h of pMCAO rats

A组、B组和C组大鼠24 h和48 h血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α数值见表2。A组与B组比较，A组24 h亚组的IL-1β (Z=-2.236，P=0.025)、IL-6 (Z=-2.236，P=0.025)、TNF-α (Z=-2.249，P=0.024)均显著低于B组，IL-10 (Z=-1.65，P=0.099)差异无统计学意义。A组48 h亚组的IL-1β (Z=-2.141，P=0.032)、IL-6 (Z=-2.121，P=0.034)均显著低于B组。IL-10 (Z=-0.354，P=0.724)、TNF-α (Z=-1.768，P=0.077)差异无统计学意义。A组与C组比较，A组24 h亚组的IL-1β (Z=-2.121，P=0.034)、IL-10 (Z=-2.141，P=0.032)、TNF-α (Z=-2.121，P=0.034)均显著低于C组，IL-6 (Z=-1.62，P=0.105)差异无统计学意义。48 h亚组的IL-1β (Z=-0.354，P=0.724)、IL-6 (Z=-0.707，P=0.480)、IL-10 (Z=-1.768，P=0.077)、TNF-α (Z=0.000，P=1.000)差异无统计学意义。B组和C组比较，24 h亚组C组IL-1β (Z=-2.205，P=0.027)、IL-6 (Z=-1.968，P=0.049)显著低于B组，IL-10 (Z=-2.470，P=0.014)显著高于B 组。C组TNF-α略低于B 组(P=0.803)。48 h亚组IL-1β (Z=-2.323，P=0.02)、IL-6 (Z=-2.021，P=0.043)、TNF-α (Z=-2.309，P=0.021)显著低于B组，IL-10 (Z=-2.021，P=0.043)显著高于B组。

2.3 pMCAO大鼠USPIO-DSC rrCBV、rrCBF与炎性细胞因子相关性分析

B组+C组24 h和48 h各参数比值(rrCBV、rrCBF)与炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α相关性见表3、4。B组+C组24 h亚组rrCBV、rrCBF与IL-1β、IL-6呈显著负相关，与IL-10呈显著正相关，rrCBV与TNF-α呈显著正相关，对相关系数进行统计分析，差异有统计学意义(P＜0.05)。B组+C组48 h亚组rrCBV、rrCBF与IL-1β呈显著负相关，rrCBV与IL-10呈显著正相关，对相关系数进行统计分析，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 pMCAO大鼠USPIO-DSC rrCBV、rrCBF观察者间一致性检验

pMCAO大鼠24 h和48 h rrCBV、rrCBF观察者间一致性检验见表5。

3 讨论

脑梗死发生后，死亡的神经元等脑细胞释放损伤相关模式分子蛋白(damage associated molecular pattern molecules，DAMPs)，激活脑内作为主要免疫效应细胞的小胶质细胞，诱导炎性反应级联。活化的小胶质细胞分为2大类，一类是促炎型(M1型)，释放促炎的细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等，一类是抗炎型(M2型)，释放抗炎的细胞因子IL-4、IL-10等。脑梗死后炎性反应在脑梗死的演化过程中具有双重作用，一方面损害血脑屏障，破坏血管结构，趋化白细胞浸润，造成神经血管单元的破坏和脑水肿。另一方面募集巨噬细胞吞噬梗死区死亡细胞、血管碎片等，诱导内皮细胞增殖，促进血管生成和神经血管单元重塑，改善神经功能预后。炎性反应是一把双刃剑，脑梗死后适度的炎性反应是有利的，过度的炎性反应不利于脑组织修复，因此调控脑梗死后炎性反应成为近些年来研究的靶点之一[13]。大量实验研究证实[14-15]，下调促炎细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α的水平和上调抗炎细胞因子IL-10等的水平可以减轻tMCAO大鼠脑梗死的体积和改善神经功能预后。针刺作为脑梗死治疗的重要手段，其减轻脑梗死后炎性反应已在众多实验研究中得到证实[16-19]。Geng等[16]研究发现针刺水沟、内关穴能减轻脑缺血再灌注(I/R)大鼠急性期脑梗死体积，并通过上调脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表达经由DOR-BDNF/TrkB信号通路抑制促炎细胞因子IL-1β的表达和促进抗炎细胞因子IL-10的表达来抑制脑梗死后急性期炎性反应。王金海等[19]也提出上调IL-10的表达，抑制IL-1β、IL-6等促炎细胞因子的过度表达，可能是头穴针刺调节缺血性脑血管病炎性反应的机制之一。本研究结果显示大鼠脑梗死后24 h和48 h，针刺可以显著降低大鼠血清中的促炎细胞因子IL-1β、IL-6水平及升高大鼠血清中的抗炎细胞因子IL-10水平，另外可以降低48 h大鼠血清中的TNF-α水平，与上述实验研究结果基本相符。

脑梗死后阻塞血管的再通以尽早恢复责任血管供应范围内的血流对挽救缺血脑组织和改善神经功能预后至关重要，目前溶栓或血管内机械取栓是急性脑梗死治疗最有效的策略之一，但由于其较窄的治疗时间窗及出血等并发症，只有约5%的患者能从中获益，绝大多数患者急性脑梗死后梗死区及周围血流的恢复依赖于侧支循环的逆行血流，因此改善梗死区域侧支循环是近些年来研究的另一重要靶点[20]。研究表明应用血液稀释剂降低血液黏度、诱导高血压、上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平和内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)移植等能够增加侧支循环的早期动脉生成和晚期血管生成，增加侧支循环的脑血容量和脑血流量[20]。研究证实，针刺可以改善梗死区域的侧支循环[6-7，21]。Shi等[21]研究发现电针水沟穴能够明显增加脑缺血再灌注(I/R)大鼠脑梗死急性期梗死区及周围脑组织的脑血流量，并通过促进梗死区及周围微血管内皮细胞的增生来促进血管生成，从而改善局部的侧支循环。本研究得到了相似的结果，C组24 h和48 h大鼠梗死区的rrCBV和rrCBF均显著高于B组，说明针刺能够改善梗死区的侧支循环。进一步研究发现脑梗死后急性期B组+C组24 h亚组rrCBV、rrCBF与血清IL-1β、IL-6水平呈显著负相关，与血清IL-10水平呈显著正相关，48 h亚组rrCBV、rrCBF与血清IL-1β呈显著负相关，rrCBV与血清IL-10呈显著正相关。笔者分析认为针刺在减轻脑梗死后炎性反应与改善侧支循环表现出协同作用，其可能的机制与针刺调节脑梗死区活化的小胶质细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞的功能有关[21-23]，针刺促进活化的M1型小胶质细胞向M2型转化，发挥抗炎作用，减轻血脑屏障的破坏，进一步调节邻近星型胶质细胞功能促进受损及新生血管血脑屏障的完善，另外针刺可以减轻血管平滑肌痉挛及促进内皮细胞的增殖，从而促进脑梗死后侧支循环的动脉生成和血管生成进而增加梗死区域的脑血流量和脑血容量。本研究结果显示B组与C组24 h亚组的TNF-α水平未见明显差异，针刺对TNF-α调节作用始于缺血后48 h。TNF-α是具有双重作用的细胞因子[24]，兼具有神经毒性和神经保护作用。TNF-α在脑梗死急性期具有扩血管及维持梗死区脑血容量的作用[25]。本研究结果提示脑梗死急性期较早的时候针刺具有选择性调节TNF-α的可能性，但需进一步实验研究探明。

本实验研究有一定的局限性。首先，本次实验造模大鼠数量较少，观察的时间点设置较少，无法充分反映针刺对脑梗死后急性期血清炎性细胞因子及脑梗死区侧支循环状态的影响。其次，我们没有对脑梗死区脑实质内的炎性细胞因子进行检测，因而无法阐述针刺对脑梗死区脑实质内的炎性细胞因子的直接影响。第三，针刺减轻脑梗死后炎性反应与改善梗死区侧支循环血供的协同机制有待进一步深入研究，后续实验研究正在进行中。

总之，本实验研究初步证实针刺通过调控大鼠脑梗死急性期血清炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的水平来减轻脑梗死后炎性反应，进而改善脑梗死区侧支循环血供。

利益冲突：无。