基于黔产刺梨“消食”作用的减肥活性及其机制研究

隋 怡，杨 平，夏仁侠

(贵州中医药大学 药学院，贵州 贵阳 550025)

黔产刺梨(Rosa roxburghii)为蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实，又名茨梨、文先果，产自贵州西部，其富含大量的维C和SOD等多种成分。《贵州民间方药集》记载其功效为“健胃，消食积饱胀，并滋补强壮”。《四川中药志》中记载刺梨“解暑，消食”。现代研究表明刺梨还具有调节机体免疫功能、延缓衰老、抗动脉粥样硬化和抗肿瘤等功能。其果实为药食两用的天然植物。

肥胖是全球流行病。人们的饮食和生活方式的改变是肥胖病例增长的主要原因，其并发症包括糖尿病和癌症[1]。因此，预防肥胖将有助于预防其并发症，从而改善肥胖患者的生活质量。肥胖及其并发症与炎症过程密切相关[2]，如TNF-α可直接降低胰岛素敏感性[3-5]。而脂肪组织巨噬细胞是脂肪组织中TNF-α和其他促炎因子的主要来源[2]。由于刺梨等天然药食两植物中含有维生素C等天然抗炎成分，使这些植物治疗肥胖成为可能。

基于以上研究及黔产刺梨“消食”作用，我们考察了ig黔产刺梨果汁对昆明种小鼠体质量的影响，同时考察用刺梨含药血清和刺梨果汁孵育后，对小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)的PPAR-α、PPAR-γ及对IL-6、IL-10基因表达的影响。为进一步探讨基于黔产刺梨“消食”作用的减肥活性及其机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞 SPF级健康成年雄性昆明种小鼠，体重18～22 g，购自长沙天勤实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2009-0012。SPF级健康成年雄性SD种大鼠，体重180～220 g，购自长沙天勤实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0014。小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)，购自上海奥陆生物科技有限公司。

1.1.2 试剂 RNAiso Plus(TaKaRa公司，货号9108)、PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa公司，货号RR047A)、TB Green(Takara公司，货号RR820A)、引物设计与合成(上海捷瑞生物工程有限公司)、DEPC水(碧云天，货号R0021)。

1.1.3 主要仪器 JA2003N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)、ND-2000(NaNoDop 2000)微量紫外-可见分光光度计(美国Thermo Scientific公司)、22331型多功能梯度PCR仪(Matercycler gradient，德国Eppendorf公司)、CFX-connect型荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 黔产刺梨果汁与刺梨含药血清的制备 新鲜黔产金刺梨10 kg，加适量双蒸水榨汁，取双蒸水定容至6 L，制备含生药1.66 kg·L-1刺梨果汁备用。取此刺梨果汁，用DMEM高糖培养基定容，制成含果汁15%的刺梨果汁备用。

SD健康雄性成年大鼠30只，180～220 g，随机分5个大鼠笼饲养，每笼6只，每日给予正常饮食和饮水，每日ig给予刺梨果汁(含生药浓度为1.66 kg·L-1)，每日2次，两次之间间隔4 h。连续给药7天，末次给药1 h后处死各组大鼠，取血，离心分离血清，取血清过0.22 μm微孔滤膜除菌，取刺梨含药血清，用DMEM高糖培养基定容，制成含血清15%的刺梨含药血清备用。

1.2.2 黔产刺梨果汁对小鼠体质量影响 昆明种小鼠20只，SPF级健康成年雄性，体重18～22 g，分为正常组(ig，生理盐水)和刺梨果汁组(ig，含生药1.66 kg·L-1)，每组10只，各组小鼠每日ig给药1次，连续给药6天，观测小鼠体质量并记录。

1.2.3 小鼠巨噬细胞培养、分组、造模与给药 培养RAW264.7细胞，用含10%胎牛血清，1%双抗的DMEM高糖培养基培养至对数生长期。分为9组：正常组、刺梨含药血清组、刺梨果汁组、M1组、M1+刺梨含药血清组、M1+刺梨果汁组、M2组、M2+刺梨含药血清组、M2+刺梨果汁组，每组3个复孔。其中刺梨含药血清组、M1+刺梨含药血清组、M2+刺梨含药血清组用含15%刺梨含药血清的DMEM高糖培养基孵育8 h；刺梨果汁组、M1+刺梨果汁组、M2+刺梨果汁组用含15%刺梨果汁的DMEM高糖培养基孵育8 h。之后造模：M1组、M1+刺梨含药血清组、M1+刺梨果汁组用脂多糖(LPS)100 ng·mL-1孵育12 h，诱导其转变为M1型巨噬细胞；M2组、M2+刺梨含药血清组、M2+刺梨果汁组用IL-4 10 ng·mL-1孵育12 h，诱导其转变为M2型巨噬细胞。

1.2.4 实时定量RT-PCR法检测RAW264.7细胞PPAR-α、PPAR-γ、IL-6和IL-10基因的表达 RNA的提取与纯化：取各组RAW264.7细胞，按RNAiso Plus试剂盒说明书提取各组RNA，RNA沉淀用DEPC水100 μL溶解备用。RNA纯度检测、浓度计算与稀释：紫外可见分光光度计检测RNA纯度，OD260/OD280>1.7认为RNA纯度达到要求，RNA浓度(ng·μL-1)=OD260·40。按检测的RNA浓度用DEPC水稀释，配制200 ng·μL-1的RNA样品稀释液50 μL备用。逆转录：取6 μLRNA稀释液按PrimeScript RT reagent Kit试剂盒说明书逆转录成cDNA，用DEPC水稀释成浓度为10 ng·μL-1备用。引物序列见表1。

表1 RT-PCR所用引物

逆转录条件：25 ℃×10 min，37 ℃×2 h，85 ℃×5 min，4 ℃后取出。

PCR扩增：配置15 μL反应体系，包括3 μL cDNA稀释液、7.5 μL TB Green、0.5 μL混合引物(表1)、4 μL DEPC水。反应条件：95 ℃×10 min，3个循环；95 ℃×10 s，60 ℃×1 min，40个循环；95 ℃×1 min，55 ℃×1 min，55 ℃×10 s，80个循环。以GAPDH作为内参基因，根据结果对基因表达进行相对定量。

基因相对表达(%)=目的基因的表达/内参基因的表达×100%

2 结果

2.1 黔产刺梨果汁ig给药对小鼠体质量的影响

黔产刺梨果汁对小鼠体质量影响结果如图1，从ig给药第5天开始，与正常组小鼠相比，刺梨果汁组小鼠体质量开始下降，在给药第6天时明显低于正常对照组(P<0.05)。如图1所示。

注：与同时间正常组相比，*P<0.05。

2.2 黔产刺梨含药血清、刺梨果汁对RAW264.7细胞PPAR-α、PPAR-γ基因表达的影响

如表2所示，与M1组相比，M1+刺梨含药血清组、M1+刺梨果汁组PPAR-α基因相对表达显著升高(P<0.05)；M1+刺梨含药血清组PPAR-γ基因相对表达显著升高(P<0.05)。与M2组相比，M2+刺梨含药血清组PPAR-α基因相对表达显著升高(P<0.05)；M2+刺梨果汁组PPAR-γ基因相对表达显著降低(P<0.05)。

2.3 黔产刺梨含药血清、刺梨果汁对RAW264.7细胞IL-6、IL-10基因表达的影响

如表3所示，与正常组相比，刺梨果汁组、M1组、M2组IL-6基因相对表达显著升高(P<0.05)；与M1组相比，M1+刺梨含药血清组、M1+刺梨果汁组IL-6基因相对表达显著降低(P<0.05)；M1+刺梨含药血清组IL-10基因相对表达显著升高(P<0.05)。与M2组相比，M2+刺梨果汁组IL-6基因相对表达显著降低(P<0.05)。

表2 黔产刺梨含药血清、刺梨果汁对小鼠巨噬细胞PPAR-α、PPAR-γ基因表达的影响

表3 黔产刺梨含药血清、刺梨果汁对小鼠巨噬细胞IL-6、IL-10基因表达的影响

3 讨论

基于中药经典古籍记载的黔产刺梨“消食”作用，我们在黔产刺梨果汁ig给药对小鼠体质量影响实验中发现，用刺梨果汁(含生药1.66 kg·L-1)灌胃小鼠(每日ig给药1次，连续给药6天)，从ig给药第5天开始，刺梨果汁组小鼠体质量开始下降，并给药第6天时显著低于正常组小鼠体质量(P<0.05)，显示了黔产刺梨果汁具有降低小鼠体质量的作用。

PPAR-α为脂肪代谢相关的重要因子，可以促进脂肪分解，加快脂肪组织代谢[6]。在诱导后的M1型巨噬细胞中，刺梨含药血清和刺梨果汁孵育使RAW264.7细胞PPAR-α的表达均显著升高；在M2型巨噬细胞中，刺梨血清组PPAR-α的表达均显著升高。表明刺梨含药血清对M1型和M2型巨噬细胞均有促进PPAR-α基因的表达作用。可见黔产刺梨可以促进M1型和M2型巨噬细胞PPAR-α基因的表达，从而加速机体的脂肪分解，达到减肥的作用。

脂肪组织炎症作用与肥胖之间有密切关系[2]：在肥胖患者脂肪组织中，M1表型的巨噬细胞占多数；在纤瘦的机体脂肪组织中，M2表型的巨噬细胞占多数[3]。肥胖导致脂肪组织巨噬细胞由M2表型向M1表型转化，M1表型巨噬细胞分泌炎症因子，加重脂肪组织炎症，最终将导致胰岛素抵抗等肥胖并发症[7]。PPAR-γ为脂肪组织巨噬细胞由M1表型向M2表型转化的必须因子[3]。与正常组的小鼠巨噬细胞相比，M1型巨噬细胞表达的PPAR-γ升高，M2表型的小鼠巨噬细胞表达的PPAR-γ降低，这可能是机体的自我保护机制，即当机体脂肪组织巨噬细胞多为M1表型时，巨噬细胞PPAR-γ表达升高，使其向M2表型转化，而当机体巨噬细胞多为M2表型时，机体又会抑制PPAR-γ的表达。与M1表型巨噬细胞组相比，M1+刺梨含药血清组的PPAR-γ表达显著升高，显示刺梨含药血清能够促进M1细胞PPAR-γ的表达，从而促进其向M2表型转化。而M1+刺梨果汁组这一作用较刺梨含药血清组弱，显示其作用主要依赖机体对刺梨的代谢。

IL-6为重要的致炎因子，由M1型巨噬细胞分泌[8]。与正常未分化组相比，M1表型组的IL-6显著升高，显示造模成功；与M1组相比，M1+刺梨含药血清组与M1+刺梨果汁组均能显著降低IL-6的表达，显示两者均可以抑制M1型巨噬细胞炎症，缓解由肥胖导致的脂肪组织炎症，减轻胰岛素抵抗。与M2组相比，IL-6在M2+刺梨果汁组表达显著降低，显示在M2表型为主的巨噬细胞中，刺梨果汁具有抗炎作用。

IL-10为抗炎因子，由M2型巨噬细胞分泌[9-11]。与M1表型巨噬细胞相比，IL-10在M1+刺梨含药血清组表达显著升高，可能是由于刺梨含药血清能够显著升高M1型巨噬细胞PPAR-γ基因的表达，进而诱导M1表型向M2表型转化所致。与M2表型相比，用刺梨含药血清孵育后，可以升高抗炎因子IL-10的表达，显示刺梨含药血清可以协同M2表型的抗炎作用。

综上所述，黔产刺梨含药血清可以诱导M1表型巨噬细胞PPAR-α基因表达显著增加，加速脂肪组织分解利用；诱导M1表型巨噬细胞PPAR-γ基因表达显著增加，促使脂肪组织巨噬细胞由M1表型向M2表型转化；诱导M1表型巨噬细胞IL-6基因表达显著降低和IL-10基因表达显著升高，可能与其促进脂肪组织巨噬细胞表型向M2表型转化有关。基于以上研究发现，今后将进一步研究黔产刺梨的减肥活性和抗炎作用，以期发掘黔产刺梨的减肥药用价值并探究其作用机制。