通络颈肩巴布剂离体小鼠经皮渗透行为及其动力学考察研究

郑小燕，张慧慧，黄倩倩，申玉婷

(阳江市中医医院，广东 阳江 529500)

神经根型颈椎病属中医“痹证”“颈肩痛”范畴。《素问·长刺节论》曰：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹。”临床治以升阳解肌、通络止痹，提高治疗神经根型颈椎病的疗效，达到科学、有效、价廉、安全可靠的目的。

通络颈肩巴布剂处方由葛根、黄芪、威灵仙、全蝎、甘草等八味中药组成，为阳江市中医医院针灸科临床使用多年的外用敷贴，其临床应用是将该处方中药打粉，蜂蜜调和后，贴敷于病灶部位，临床疗效确切，深受患者认可。随后改良为更适合患者使用的载药量大，且无刺激性的巴布剂，该制剂通过升阳解肌、通络止痹之功效对颈椎病具有很好的临床疗效。本研究考察制备的巴布剂的透皮性能，选择君药葛根中有效成分葛根素为检测指标，考察其体外释放度、离体透皮率及制备的巴布剂动力学释放行为，具体研究如下。

1 实验仪器与材料

1.1 实验仪器

高效液相色谱仪：waters e2695；色谱柱：赛诺菲ODS HYPERSIC C18分析柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；电子天平：Sartorius ME215S(Max210 g d=0.01 mg)；RYJ-6A型药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器厂)；超纯水机(上海惠分科学分析仪器有限公司)；KQ-300DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

通络颈肩巴布剂(自制，批号：20041801、20041802、20041803)；葛根素(中国食品药品检定研究院)，批号：110752-200511)；甲醇为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯；清洁级小鼠，体重(20±5)g，由湖北省疾病控制中心动物实验室提供，合格证号：(NO.4200695787)，实验动物许可证号：SCXK(鄂)2019-0030。

2 条件与方法

2.1 色谱条件

色谱柱：C18分析柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(22∶78)检测波长为250 nm，理论塔板数按葛根素峰计算应不低于2 000。流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样：20 μL。

2.2 样品的制备

2.2.1 葛根素对照品溶液的制备 分别精密称取葛根素(15.97 mg、16.02 mg)，分别置于200 mL容量瓶中，加30%乙醇，制成每1 mL含0.079 85 mg、0.080 1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取自制的通络颈肩巴布剂一贴(批号：20041801)，除去盖衬，称取膏体约0.4 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，密封，精密加入60%乙醇50 mL，称重，超声处理15 min(120 W，频率40 kHz)，放冷，用60%的乙醇补重，过滤，取续滤液，即为供试品溶液。

2.2.3 阴性溶液的制备 称取不含葛根的其余药材，自制成巴布剂，按上述“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，过滤，取续滤液即为阴性溶液。

3 方法专属性

3.1 DAD检测器纯度检验

吸取葛根素对照品溶液、供试品溶液各10 μL，进入DAD检测器对其进行纯度检查，结果表明葛根素色谱峰无杂质干扰，纯度高(95.5%)。见图1、图2。

3.2 专属性考察

按“2.1”项下色谱条件，分别将对照品溶液、供试品、阴性溶液各10 μL，进样、检测，对照品、供试品在14 min左右出现葛根素色谱峰，阴性溶液无干扰。结果见图3、图4、图5。

图1 对照品DAD检测器纯度检验

图2 供试品DAD检测器纯度检验

图3 葛根素对照品色谱

图4 供试品色谱

图5 阴性溶液色谱

3.3 线性关系试验

精密称取葛根素对照品16.02 mg，置于50 mL容量瓶中，加30%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为母液，分别在上述色谱条件下分别进样1 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL，分别进样2次，测定峰面积，计算平均峰面积，以平均峰面积、对照品含量计算线性回归方程：Y=4 224 309.291 9X-181 722.420 8(r=0.999 9)；表明葛根素在0.320 4 μg～6.408 0 μg范围内线性关系良好。

3.4 精密度试验

取上述“2.2.1”项下制备的对照品溶液，按“2.1”色谱条件，连续进样6次，每次进样10 μL，计算葛根素的峰面积RSD为0.69%，表明仪器精密度良好。

3.5 稳定性试验

取通络颈肩巴布剂一贴(批号：20041801)，除去盖衬，称取膏体约0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，密封，精密加入30%乙醇50 mL，称重，超声处理20 min(120 W，频率40 kHz)，放冷，用30%的乙醇补重，过滤，取续滤液，按“2.1”色谱条件下，分别于1、2、4、8、12、24 h进样检测，分别进样10 μL，计算葛根素的峰面积RSD为1.35%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

3.6 重复性试验

取通络颈肩巴布剂一贴(批号：20041801)，除去盖衬，称取膏体约0.5 g，称取6份，精密称定，置于锥形瓶中，密封，分别精密加入30%乙醇50 mL，称重，超声处理20 min(120 W，频率40 kHz)，放冷，用30%的乙醇补重，过滤，取续滤液，按“2.1”色谱条件下，分别进样10 μL，计算葛根素的含量为280.42 μg/g，计算RSD为1.36%，表明实验方法稳定可行。

3.7 加样回收率试验

取已知含量样品(批号：20041801)，摇匀，除去盖衬，称取膏体约0.25 g，称取6份，精密称定，各精密加入适量的葛根素对照品，分别精密加入30%乙醇50 mL，称重，按上述“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制备，摇匀，过滤，取续滤液即得，分别进样10 μL，结果平均回收率为100.16%，RSD为1.42%，表明实验方法稳定可行。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

3.8 耐受性试验

取上述“2.2.2”项下制备的供试品样品，按“2.1”项色谱条件，分别在三根不同的色谱柱上测定葛根素的含量。结果表明在三根不同的色谱柱上测定结果无明显差异。结果见表2。

表2 葛根素含量测定结果

3.9 定量限试验

精密称取葛根素对照品5.25 mg，置于50 mL容量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，摇匀，作为储备液，稀释成一系列浓度的溶液，分别进样1 μL，检测，当信噪比S/N=10即为定量限，此时葛根素含量为5.08×10-3μg。

3.10 含量测定

取三批样品，摇匀，按供试品溶液制法所得溶液，按上述“2.1”项色谱条件测定，进样10 μL，计算。结果见表3。

表3 三批验证样品含量测定结果 (μg/g)

4 离体小鼠透皮率测定

4.1 离体小鼠透皮实验[1-2]

取清洁级小鼠，脱颈处死，用电动剃刀将其腹部脱毛，脱毛切记不要损害外部皮肤，剥离小鼠皮肤，采用改良Franz扩散池，将鼠皮置于接收池上，称取通络颈肩巴布剂0.50 g，精密称定，贴敷于鼠皮部，将接收池内加满9%生理盐水，水浴恒温保持在(37±1) ℃，开启磁力搅拌(设置搅拌速度为250 r/min)，分别于1、2、4、8、12、24 h取出接收池中的接收液，同时补充同量的恒温生理盐水(37±1) ℃。

4.2 通络颈肩巴布剂透皮供试品溶液制备

分别将6个时间段接收液分别置水浴锅蒸干，用30%乙醇溶液溶解，转移至1 mL容量瓶中，并定容至刻度、摇匀，过滤，取续滤液即得。

4.3 离体透皮率含量测定

将上述制备的样品，按“2.1”项色谱条件分别注入高效液相色谱仪，分别进样10 μL，检测，计算样品中葛根素的含量及计算经皮渗透的动力学拟合。结果见表4、表5。

5 结果

由表5结果可知，通络颈肩巴布剂中葛根素经皮渗透动力学拟合符合Higuchi方程，拟合度为0.918，表明葛根素有效组分含量逐步缓慢释放，在皮肤角质层进行贮库蓄积，从而进行低速运输，表明该制剂为骨架型缓释制剂。

表4 离体透皮率测定结果

表5 经皮渗透动力学拟合方程

6 讨论

现代药理研究证实，葛根素能显著增加颈椎肌肉群收缩力，增加肌纤维弹性，软化韧带，可阻止椎间盘纤维化和椎间盘退变[3]。

神经根型颈椎病是颈椎病中的常见临床亚型，在所有类型中它的发病率最高，占70.2%。其主要表现为颈肩臂部疼痛，上肢放射性麻木疼痛，上肢肌力减退，甚者出现肌肉萎缩[4]。

本实验制备的巴布剂通过药动学拟合，发现为骨架型透皮制剂。骨架型透皮贴比贮库型更薄更小，且皮肤刺激性小，因此，患者的顺应性更好，为目前经皮领域研究的热点[5]。制备的通络颈肩巴布剂缓控释制剂可实现药物释放的定时、定位、定速，从而可使药物发挥出更好的疗效。