不同产地绵马贯众饮片标准汤剂制备与质量标准研究

姚 娜，黄燕明，李雪银，陈桂生，康志英，3，徐 超，张立明

(1.广州市香雪制药股份有限公司，广东 广州 510663；2.隆德县六盘山中药资源开发有限公司，宁夏 固原 756300；3.广东香雪南药发展有限公司，广东 肇庆 526642；4.宁夏职业技术学院，宁夏 银川 750000；5.宁夏医科大学 药学院，宁夏 银川 750004)

标准汤剂又称标准煎液，是一种传统的临床广泛使用的用药形式。标准汤剂系遵循中医药理论，按照临床汤剂煎煮方法规范煎煮，固液分离，经适当浓缩制备或经适宜方法干燥制得，作为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。

绵马贯众为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨DryopteriscrassirhizomaNakai的干燥根茎和叶柄残基。秋季采挖，削去叶柄、须根，除去泥沙，晒干。道地产区为吉林，主产区有黑龙江、吉林和辽宁。其具有清热解毒，驱虫的功效，临床上多用于治疗虫积腹痛、疮疡[1-2]。药理研究表明，绵马贯众有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、驱虫等作用[3-4]。绵马贯众主要化学成分有间苯三酚类、黄酮类、萜类、甾体类、苯丙素类以及脂肪族类化合物等[5-8]。绵马贯众属于冷背药材，对其研究报道不多。目前，关于绵马贯众标准汤剂制备及标准研究未见报道。本研究从标准汤剂的角度，收集15批绵马贯众饮片为原料，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》和《医疗机构中药煎药室管理规范》，对其进行标准汤剂制备研究，并进行质量标准研究，以期为绵马贯众水提物及配方颗粒的质量评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；MS204TS万分之一电子分析天平(瑞士Mettler toledo公司)；Simplicity超纯水器(美国密理博Millipore公司)；KQ500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

绵马贯众对照药材(中国食品药品检定研究所，121034-200302，规格：1.0 g/瓶)。

乙腈(天津赛孚瑞公司，色谱级)；醋酸为分析纯，GENERAL-REAGENT；甲醇(国药集团化学试剂厂，分析纯)。

1.3 样品

共收集15批绵马贯众饮片，均为野生品，辽宁西丰县3批，吉林白山6批，黑龙江伊春3批，辽宁清原3批；包含了绵马贯众药材的道地产区和主产区。样品经广州市香雪制药股份有限公司高级工程师康志英鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 绵马贯众饮片标准汤剂制备

取绵马贯众饮片100 g，加8倍量水，浸泡30 min，煎煮20 min，滤过；第二次加6倍量水，煎煮15 min，滤过，滤液合并，减压浓缩至饮片投料量∶浸膏体积约为1∶1(g∶mL)的浸膏，冷冻干燥，即得。

2.2 绵马贯众饮片标准汤剂薄层鉴别

取本品粉末1.0 g，加沸水50 mL，搅拌使溶解，滤过，滤液用盐酸酸化至pH=2～3，置分液漏斗中，用无水乙醚萃取3次，合并乙醚液，浓缩至干，残渣加氯仿3 mL使溶解，作为供试品溶液。另取绵马贯众对照药材1.0 g，加水50 mL，煎煮1 h，离心取上清液，同法制成对照药材溶液。按照薄层色谱法(《中国药典》2015版四部通则0502)试验，吸取上述2种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-冰醋酸(12∶1∶0.25)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.3%坚牢蓝BB盐稀乙醇溶液，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点，见图1。

注：1.绵马贯众对照药材；2.标准汤剂(MAGZ-01)；3.标准汤剂(MAGZ-02)；4.标准汤剂(MAGZ-03)；5.标准汤剂(MAGZ-04)；6.标准汤剂(MAGZ-05)；7.标准汤剂(MAGZ-06)；8.标准汤剂(MAGZ-07)；9.标准汤剂(MAGZ-08)；10.标准汤剂(MAGZ-09)；11.绵马贯众对照药材；12.标准汤剂(MAGZ-10)；13.标准汤剂(MAGZ-11)；14.标准汤剂(MAGZ-12)；15.标准汤剂(MAGZ-13)；16.标准汤剂(MAGZ-14)；17.标准汤剂(MAGZ-15)。

2.3 绵马贯众标准汤剂指纹图谱研究

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters Symmetry®-C18色谱柱(柱长为25 cm，柱内径为4.6 mm，粒径为5 μm)；以乙腈为流动相A，以1%醋酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为330 nm。

时间(min)流动相A(%)流动相B(%)0-1510→2090→8015-2520→4080→6025-4040→6060→40

2.3.2 参照物溶液制备 取绵马贯众饮片约1.0 g，精密称定，加水50 mL，煎煮30 min，取出，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加适量甲醇超声处理使溶解，取出，放冷，转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为饮片参照物溶液。取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成40 μg/mL的溶液，作为对照品参照物溶液。

2.3.3 供试品溶液制备 取本品粉末1.0 g，精密称定，精密加甲醇50 mL，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 专属性试验 取绵马贯众饮片标准汤剂,按供试品溶液制备方法制备，按“2.3.1”项下的色谱条件测定，结果表明，12个共有色谱峰的鉴定均不受溶剂因素干扰，具有良好的专属性。

2.4.2 精密度试验 取同一批绵马贯众饮片标准汤剂样品依法制备，按色谱条件测定，连续进样6次，每次10 μL，记录色谱。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》进行评价，结果显示相似度均大于0.90，表明该仪器的精密度良好。

2.4.3 重复性试验 取同一批绵马贯众饮片标准汤剂样品，平行6份，依法制备，按“2.3.1”项下的色谱条件分别进样，记录色谱。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》进行评价，结果显示相似度均大于0.90，表明该方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验 取同一份供试品溶液，按色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h进样分析，记录色谱。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)》进行评价，结果显示相似度均大于0.90，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱的构建

取15批绵马贯众饮片标准汤剂，按供试品溶液制备方法和色谱条件测定，得到15批绵马贯众饮片标准汤剂的色谱叠加图(图2)。根据相对保留时间稳定及各批次样品均能检出的原则，选择了12个特征峰作为共有峰。

图2 15批绵马贯众饮片标准汤剂HPLC指纹图谱叠加

2.6 绵马贯众饮片-提取液-冻干粉指纹图谱关联性分析

测定同批次饮片、提取液、标准汤剂溶液，制备方法制备供试品，测定，结果绵马贯众饮片、水提液、标准汤剂冻干粉的色谱图上均呈现12个共有峰(见图3)，且相似度均大于0.90，说明绵马贯众饮片-水提液-冻干粉相关性良好。

图3 绵马贯众饮片-水提液-标准汤剂HPLC指纹图谱叠加

3 讨论

本研究在薄层鉴别方法探索过程中，笔者首先参照《中国药典》2015版一部“绵马贯众”【鉴别】项下薄层色谱方法，结果供试品色谱中在与饮片溶液色谱相应的位置上，均没有斑点出现，分析原因为冻干粉是由饮片经过水煮后所得，大部分成分为极性大的物质，环己烷为极性小的溶剂，药典方法处理所得的供试品大多为小极性物质，因此药典方法不适用于冻干粉的薄层鉴别，于是更换薄层鉴别方法进行探索。

在流动相条件考察时，考察酸的种类及浓度对色谱峰型及分离度的影响，结果发现，1%醋酸色谱峰分离度较好，故选择乙腈-1%醋酸溶液作为流动相进行梯度洗脱。

采用光电二极管阵列检测器考察绵马贯众标准汤剂供试品溶液在不同波长下色谱图情况。供试品溶液在190～400 nm波长下进行扫描，通过3D视图和等吸收图谱进行分析，通过供试品溶液在不同波长下的色谱图比较发现，在230～400 nm波长范围内，基线较平稳，250～330 nm信息逐渐增多，340 nm以后色谱峰信息逐渐减少，在330 nm色谱峰响应值适中，信息量较大，故选330 nm作为检测波长。

综上所述，本试验中绵马贯众饮片标准汤剂的制备方法简单，所建立的TLC定性鉴别法及HPLC法测定指纹图谱的方法简便、可靠，可为绵马贯众配方颗粒的质量评价提供参考。