酱油中氨基甲酸乙酯形成机制、检测技术及控制研究进展

叶月华，刘晓艳 *，白卫东，黄汉聪

（1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广东 广州 510225；2.广州市如丰果子调味食品有限公司，广东 广州 510300）

酱油的历史源远流长，得益于其特有的色、香、味、体而备受欢迎，不仅可以增加消费者的食欲，而且具有较高的营养价值，因此成为我国传统的发酵调味品之一。但美中不足的是，在酱油酿造过程中，会自发性地产生有毒有害的可能致癌物质即氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）。迄今，很多研究者在其他发酵食品和酒精饮料也检测到EC的存在。据报道[1]，酱油中EC的含量范围是＜检出限（limit of detection，LOD）～43.93 ng/g，而酒类中EC的含量范围是＜LOD～239.40 ng/g。尽管酱油中EC的含量相对于酒精饮料中EC的含量较低，但酱油在人们的日常饮食当中占据不可或缺的地位，毫无疑问日积月累的摄入量仍然会给人体的健康带来一定隐患，很可能成为EC的主要危害来源[2]。联合国粮农组织规定EC含量≤20 μg/L[3]；1985年，加拿大对各类酒中的EC限量标准作出规定：白兰地和烈性酒不能超过0.4 mg/L，强化葡萄酒和日本清酒不能超过0.10 mg/L，蒸馏酒不能超过0.15 mg/L，佐餐葡萄酒不能超过0.03 mg/L；1988年，美国也限定了葡萄酒中EC的含量：佐餐葡萄酒不得超过0.015 mg/L，餐后葡萄酒不得超过0.06 mg/L[4]；然而我国尚未对发酵制品中EC制定限量标准。“民以食为天，食以安为先”。随着人们对食品安全重视程度的提高，作为酱油生产大国应尽快解决酱油中EC的形成机理及减除的问题。因此，很有必要探究如何抑制酱油生产过程中产生的有害物质，有利于保障我国传统发酵食品的安全性和维护其国际形象[5]。本文针对酱油中EC的危害、形成机制、检测技术及调控措施等方面进行综述，以期为酱油中EC的控制，提高酱油的安全性提供参考。

1 氨基甲酸乙酯的概况

氨基甲酸乙酯又称为乌拉坦（urethane），易溶于水、乙醇和乙醚，分子式为C3H7NO2，分子质量为89.09。早年EC的用途相当广泛，是制造香料、医药等的中间材料及用于生物化学研究。20世纪40年代初，EC是主要的麻醉药；1943年，NETTLESHIP首次发现了EC的致癌性，只是当时EC在食品中的含量并未足够引起人们的重视[6]；1974年，国际癌症研究机构确定EC为2B类致癌物质，直到2007年，再次将EC从2B类致癌物质列入2A类致癌物质[7]。自此，学者们深入剖析了EC的致癌机理，发现EC属于多位点致癌物，可以通过多种途径进入人体内，其中大概5%的EC无须代谢以排泄物的形式直接排出体外；而90%以上的EC在肝脏细胞的微粒酯酶水解作用下产生乙醇、氨和碳水化合物并被代谢掉；还有0.1%左右的EC通过线粒体中的细胞色素P450作用下氧化成N-羟基-氨基甲酸乙酯，N-羟基-氨基甲酸乙酯会诱发部分器官中的酯酶产生O2-及NO，Cu2+可以催化NO和O2-产生过氧化氮，最终形成8-羟基-脱氧鸟苷，随后会导致脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）发生碱基颠换，由此诱发癌变[8]。此外约0.5%的EC被细胞色素P450氧化成乙烯基氨基甲酸乙酯，后转化成的乙烯基氨基甲酸酯环氧化物能够与脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）等结合诱发碱基对置换从而造成DNA损坏。目前国内研究EC的对象主要是酒类，而其他酿造食品如酱油中EC的研究相对较少，这是一项亟待解决的工作[9]。

2 酱油中氨基甲酸乙酯的形成机制

已有文献报道，EC的形成与其前体物质的种类和含量有关，而前体物又和发酵微生物本身性质密切相关（如酿酒酵母可以代谢精氨酸为尿素，而酱油中的乳酸杆菌可以代谢精氨酸为瓜氨酸）[10]。由于发酵制品中的EC主要是由乙醇和尿素、瓜氨酸等前体物质自发反应产生的，因此酒中大量的乙醇为EC的形成提供了更好的环境，所以其EC的平均含量（35.74 ng/g）比酱油中EC的平均含量（23.45 ng/g）高，如表1所示[1]。但两者中EC的具体形成机制是否一样还需进一步研究。

表1 市售酒类和酱油中的氨基甲酸乙酯含量检测结果Table 1 Determination results of ethyl carbamate contents in commercial alcoholic beverage and soy sauce

在高盐稀态酱油发酵过程中，酿造原料会被微生物分解成小分子物质，有一部分会进入常见酵母菌（如鲁氏接合酵母、毕赤酵母等）后经糖酵解途径（embden meyerhof pathway，EMP）和鸟氨酸循环（ornithine cycle）这两种途径生成的尿素和乙醇被释放到细胞外；另一部分则经胞内精氨酸脱亚氨酶途径被嗜酸乳酸足球菌利用，从而代谢精氨酸生成瓜氨酸和氨甲酰磷酸被释放到细胞外，这两种重要的中间物质在整个发酵环境体系中聚合后，由特定的酶的催化下从而形成EC。

MATUSUDO T等[11]曾认为酱油中EC的主要前体物质是瓜氨酸，这是分别通过研究日式酱油和国内酱油分析前体物的添加与EC生成量的关系得出的重要结论。乳酸发酵时期和乙醇发酵时期都能积累瓜氨酸，但实验发现瓜氨酸的主要积累时期是乳酸发酵期。瓜氨酸在乳酸发酵期主要是通过嗜酸乳酸足球菌代谢精氨酸产生的，在酱油的高盐条件下，嗜酸乳酸足球菌在精氨酸脱亚氨酶途径中分别负责编码精氨酸脱亚胺酶和鸟氨酸转氨甲酰酶的两个关键基因arcA和arcB的表达量缩减，造成瓜氨酸的生成速率大于其降解速率，从而导致瓜氨酸的积累；瓜氨酸在乙醇发酵期的积累则是因为游离脂肪酸的存在促使更多的精氨酸转化成瓜氨酸。此外，pH和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）等环境因素也会影响精氨酸脱亚氨酶途径中编码精氨酸脱亚氨基酶（arginine desiminase，AD）arc A；编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶（ornithine carbamyl transferase，OCT）arc B；编码氨甲酰磷酸激酶（carbamyl phosphate kinase，CPK）arc C这3种关键基因的表达，进而对酱油中瓜氨酸的积累产生影响。

由于酱油样品易受生产原料、发酵方式、工艺、产地等因素的限制，因此不同地区和不同酿造工艺的酱油中EC含量会大相径庭（见表2）[13]。通常情况下，添加入酵母的酱油EC含量高于传统工艺酱油的，原因是外源性加入的酵母菌会通过代谢精氨酸产生尿素，致使EC含量也会随之增加。

表2 不同地域和各类生产工艺酱油中的氨基甲酸乙酯含量Table 2 Ethyl carbamate contents in soy sauce in different regions and various production processes

3 酱油中氨基甲酸乙酯的检测方法

由于EC浓度低、在定量测定时还会受到不同基质不同程度的干扰，因此需要特别灵敏的方法[14]。当前国内外专家学者始终致力于对检测酱油中EC的研究方法进行不断的优化。目前，已有报道的针对酱油中EC的检测方法[15]主要有气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术、气相色谱-串联质谱（gas chromatographytandem massspectrometry，GC-MS/MS）技术、高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技术、高效液相色谱-荧光检测器（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）技术和荧光光度（fluorophotometry）法等。

3.1 气相色谱-质谱联用技术

气相色谱-质谱联用是多数文献所提及到的用于检测食品中EC含量的方法，其结合了色谱法的高分离效能与质谱法的高鉴别能力，对EC达到同时定量、定性的检测目的。以下是研究者将酱油样品采用不同的前处理方法，包括液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）、固相萃取（solidphaseextraction，SPE）、固液萃取（solid liquid extraction，SLE）、分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，DSPE）、顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HSSPME），结合GC-MS对测定结果等方面进行分析比较，以此验证方法的可行性与可靠性。

3.1.1 固相萃取结合气相色谱-质谱联用法

吕昱等[16]建立一种使用选择离子扫描（selective ion monitoring，SIM）模式以及外标法的固相萃取结合GC-MS方法来检测贵州当地的市售酱油，其中酱油需在萃取小柱中停留30 min，而后选择1∶9（V/V）的丙酮-二氯甲烷来洗脱EC，由于EC易溶于C18萃取柱中，所以固相萃取（SPE）比液液萃取（LLE）更能有效分离提取酱油中的EC。结果显示，EC的含量为340～440 μg/mL，在1～10 μg/mL范围内呈现良好的线性关系，检测限为0.014 μg/mL，定量限（S/N=10）为0.048 μg/mL，加标回收率达97.78%，加标回收率结果的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.59%；其特点在于较高的灵敏度、良好的精密度以及较广的线性范围等，能够达到定性定量的目的。

3.1.2 固液萃取结合气相色谱-质谱联用法

肖泳[17]分别采用液液萃取（LLE）和固液萃取（SLE）对酱油中EC进行前处理，其中LLE使用乙酸乙酯进行洗脱，而SLE的层析柱使用可吸附颜色的活性炭-硅胶和无水硫酸钠作填充，并在条件优化中发现选择40 mL甲醇∶二氯甲烷（1∶9，V/V）使EC回收率达到90.34%～98.96%，日内精密度RSD为2.61%～4.67%，日间精密度RSD为3.53%～6.05%，结合GC-MS检测出EC在20～1 500 μg/L质量浓度范围内有着良好的线性关系，检测限（S/N＞3）为4 μg/L；然而LLE法的日内精密度RSD为4.14%～5.27%，日间精密度RSD为4.53%～7.22%，不仅回收率最低达不到70%，还存在大量色素和造成离子源污染。综上研究发现，SLE法相比于LLE法具有更高的精准度、更好的重现性且有机溶剂耗费少，尤为凸显其环保性。因此，SLE结合GC-MS法检测酱油中EC更具优势。

3.1.3 分散固相萃取结合气相色谱-质谱联用法

目前测定酱油中EC的GC-MS 法大多采用以硅藻土为填料的SPE进行净化处理，有学者发现DSPE比SPE法更快速、简便、稳定且无需较大的溶剂体积[18]。章晴等[19]对饮料酒中的EC用GC-MS测定时，其分散固相萃取的净化方法使用了N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA），后发现它对酱油中的氨基酸、有机酸和色素等大量干扰成分有很不错的消除能力。对此，陈达炜等[20]对酱油样品液液萃取时选择的是乙腈，DSPE净化用N-丙基乙二胺（PSA），采用气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法测定酱油中的EC。学者优化实验条件（选择离子检测模式和选取100 mg PSA粉）后发现EC在10～500 μg/L质量浓度范围内有着较好的线性相关关系，方法的检出限为2.0 μg/kg，此法简单且准确，具有很好的实际推广价值。

3.1.4 顶空-固相微萃取结合气相色谱-质谱联用法

丰帆[21]考虑到固相萃取法对样品前处理的复杂性和耗时性，在此基础上建立了顶空固相微萃取技术，用以处理不同种类酱油样品，可有效缩短时间且不需要萃取溶剂，简单方便，易稳定；分别优化了萃取纤维头、pH值、萃取时间、萃取温度等条件，同一样品经GC-MS检测所得结果与美国分析化学家协会（association of official analytical chemists，AOAC）官方检测结果比对相差无几（相关系数R2＞0.95），检出限（S/N=3）为1.0 μg/L，EC回收率达70.56%～129.21%，足以证明该方法的可行性与准确性。此外，还有待研究合成特异性吸附的纤维头涂层，可进一步提高和完善氨基甲酸乙酯的检测灵敏度和有效性。

张燕等[22]对萃取纤维涂层等分析条件的优化也建立了一种HS-SPME-GC/MS方法，顶空萃取是将纤维暴露于样品，顶空吸附不同pH值的样品，结果发现，酱油中EC的回收率达到了70.56%～129.21%，检出限为1.0 μg/L，日内精密度RSD为3.69%，日间精密度RSD为8.50%；研究表明该方法具有一定的准确性和稳定性，不足的是定量检测的精确度不高，检测范围较窄，检测周期较长。

3.2 串联质谱技术

3.2.1 气相色谱-串联质谱技术

GC-MS法因其灵敏度较高被视为测定酒中EC最为普遍的方法[21]，但酱油基体复杂会严重干扰GC-MS中绝大多数特征离子，其定性确证能力因此受到很大局限。徐小民等[23]利用有机硅藻土填充的固相萃取法提取酱油中的EC，所采用的同位素内标法比外标法大大减少将近7倍的有机溶剂用量，EC的回收率达96.2%～104.0%；后经比较多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式与选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）模式的实验结果发现，MRM模式对EC定性定量的准确性较高，检测限为2 μg/kg，还能避免SIM模式出现的基体干扰和假阳性现象。

3.2.2 高效液相色谱-串联质谱技术

PARK S K等[24]以韩国酱油作为研究对象，建立了使用高效液相色谱串联质谱（highperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry，HPLC-MS/MS）技术测定其EC含量的方法，EC的质量浓度在10～100 μg/L和0.1～20 μg/L范围内变化时，该方法均呈现良好的线性关系，检测限为0.25 μg/L；缺点是仪器设备昂贵，样品制备繁琐，测定周期较长。

综上可知，串联质谱方法要优于单级质谱法，但目前远不足以满足市场量大面广的需求。

3.3 高效液相色谱-荧光检测器技术

该方法适用于检测酒类饮料中的EC含量，样品预处理简便，设备要求简单是优点所在，但检测限却仅达20 μg/L左右[25]。由于酱油等发酵食品EC浓度水平较低，因此并不建议使用该方法测定。不过，陈可[26]通过利用乙酸乙酯萃取酱油中的EC，优化样品的衍生化反应条件以及高效液相色谱荧光检测器（high performance liquid chromatographyfluorescence detector，HPLC-FLD）法的色谱条件，使其检测限降低至5 μg/L，相关系数（R2）为0.988，平均回收率达到100.12%，能基本满足酱油中EC的检测需求。同时还利用该方法对不同种类的酱油进行了分析比较，结果发现EC含量与酿造工艺和地域存在很大的关联性，如低盐固态法和南方酱油中EC含量要高于高盐稀态法和北方酱油；对于不同功能型酱油EC含量相差无几，浓口酱油和老抽中EC含量比淡口酱油和生抽低约10%。魏华[27]分别采用紫外分光光度法、荧光光度法对酱油中的EC进行有效测定，结果经比较发现，荧光光度法对酱油中EC的最低检测限值为0.01 mg/L，低于紫外分光光度法的0.04 mg/L，表明荧光光度法检出效果更佳。黄秋婷等[28]针对酱油类样品的特点，采用优化的QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）前处理方案，更具针对性的开发了四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱的EC检测手段，在1～20 μg/L范围内相关性良好，检出限为1.5 μg/kg，具有较佳的精准度和灵敏度。

综上研究发现，从线性范围、检出限、回收率和精密度等方面对比分析后发现GC-MS法比HPLC-FLD法精准度更高、重现性更好以及检出限要低一些，显然GC-MS法会更为成熟。而HPLC-MS/MS法的准确度、重复性、灵敏度等特性也要比GC-MS更胜一筹，但美中不足的是它和气相色谱串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法一样面临仪器价格不菲和维护成本过高等问题，因此也难以推广使用。经过诸多方法的比较，目前SPE结合GC-MS法相对会占优势，在保证试剂用量少的同时还能批量操作，而且GC-MS法也是国际检测EC含量的标准[29]，倘若研究学者能够在此基础上不断优化实验条件将会是今后较有发展前景方向的检测方法。

4 酱油中氨基甲酸乙酯的控制

已有研究表明[30]，属于混菌发酵的酱油在发酵过程中会存在微生物代谢某些含氮物质，进而产生多类前体物质参与EC的合成，导致酱油潜在的安全隐患。目前很多研究策略专注于减少这些前体物质。多种方法已被开发用于控制EC的合成，普遍使用的方法有物理、微生物、理化和酶法等技术。

4.1 物理法

引入活性炭过滤技术是用于减除酱油中EC有效且常见的方法，该方法可以去除约45%～47%的EC，但活性炭过滤会导致其口感下降[31]，其应用价值受到一定的限制。据报道，黄酒中EC 的直接减除与多种材料有关，如活性炭、硅胶、硅藻土、壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）等，其中用硅藻土吸附黄酒中的EC后能最大程度地保持酒体风味，故在黄酒中使用较多，且符合经济效益。由于硅藻土产地不同，吸附性能差异很大，天然的硅藻土杂质含量也较高，会限制其在多方面的应用，需要通过提纯改性等手段进一步提高其吸附性能。曹甜等[32-33]利用碱法改性硅藻土和壳聚糖改性硅藻土，探索其对黄酒中EC的吸附性能，结果发现经过碱处理后，硅藻土对黄酒中EC的减除率大大提升，且处理后酒体风味与原酒基本一致。可以尝试将此法运用于减除酱油中的EC。

4.2 微生物干预法

张继冉[13]尝试从酱油乳酸发酵末期的酱醪样品中筛选出控制EC前体物产生的解淀粉芽孢杆菌JY06，该芽孢杆菌在高浓度NaCl条件下利用精氨酸且不积累瓜氨酸。在小型模拟生产体系中添加该菌干扰微生物群落和消耗前体物质，可以达到降低EC积累的效果。由此可知，学者通过探寻一种关键微生物是对酱油发酵过程中EC前体形成有关联性的，并理清了微生物代谢途径与EC前体生成的关系，阐述了酱油中EC的生成途径，在控制或减除酱油中EC含量这方面意义深刻，具有前瞻性。

张梦寒[34]以上述的解淀粉芽孢杆菌JY06 作为研究对象，通过高通量筛选手段对3种解淀粉芽孢杆菌JY06（分别采取紫外诱变、等离子诱变和定向驯化育种方法）进行改造，目的是提高菌株JY06 利用精氨酸的能力。学者将由此获得的若干个可高效利用精氨酸的突变株添加入在酱油发酵前期的酱醪中，结果表明，其在发酵过程中对EC及其前体瓜氨酸的降解效果甚好，且证实了该菌株不会对酱油风味品质造成影响。

4.3 优化发酵工艺

王旭锋[35]通过使用酱汁模拟体系替代完全酱醪发酵，使发酵在相对封闭环境中进行的同时，对酱油发酵中常见的原材料、常用酵母以及发酵温度3种发酵工艺条件进行调控，跟随发酵过程研究其中EC及其前体物的变化情况，找到可以在一定程度上减少EC合成的最佳工艺组合（18 ℃的低温发酵与添加鲁氏接合酵母S），从而为高盐稀态酱油发酵生产控制提供理论依据。经调查，该方法的优势在于安全性高和成本低。

4.4 酸性脲酶法

2015 年，KIM Y G等[36]以添加脲酶的韩国豆瓣酱为研究对象，在含有不同前体物（如乙醇、尿素和瓜氨酸）的发酵体系中加入此酶，结果显示，发酵后的豆瓣酱中EC含量分别下降了17.3%、18.8%和38.4%。说明脲酶用于类似的发酵食品中EC的控制会产生异曲同工之妙。但是尚未有耐高渗脲酶能够在高浓度NaCl的酱油发酵体系中完全适应的相关报道，对此还需要进一步深究。

4.5 氨基甲酸乙酯水解酶法

2006 年，日本首次从马红球菌（Rhodococcus equi）中获得了EC水解酶的序列，但该酶是对一系列氨基甲酸乙酯类化合物都有效，并非只针对于EC水解，其对EC的目的性不强。因此，EC水解酶在食品中的使用效果还有待考究。在国内，李京京等[37]从小鼠胃肠道中分离得到的赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）SC02中EC水解酶进行纯化后获得了纯酶。经验证，此酶可耐受高浓度的酒精和盐分，因此具备在酱油中消除EC的开发潜力。卜攀攀[38]从鼠胃中分离到了一株肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），特点在于其能够产耐高渗EC水解酶，学者对该酶纯化后并深究该酶的性质。研究表明，该酶在NaCl含量18%的条件下仍能保持40%的活性，因此应用在去除酱油中EC这一领域具有无限的潜在价值。可是该酶不易耐受酸的胁迫，在环境pH＜6时，酶活性显著下降。因而，该酶需要经过耐酸性改造后方可适用于酱油生产。以上这些减除策略为酱油生产中直接消除EC奠定基础的同时还提供了不少新的出路。

5 展望

目前，针对于酱油中EC的检测方法未趋成熟，还不够稳定、快速和可靠；大多数仍停留于实验室阶段，还不足以投入到大型生产当中。与本文所综述的检测手段相比较而言，酶联免疫吸附检测则具有高特异性、高灵敏度、简单快速、成本低等优点，目前对EC的酶联免疫检测技术的研究还很缺乏，可以考虑利用单克隆抗体提高酶联免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技术的特异性，研发一款高效实用的EC快速检测试剂盒，方可作为传统检测方法的一个重要的补充手段[39]。

尽管现有条件已检出存在EC，但其生成的各种条件及影响因素还有待加强研究证实，才能更好地完善减除EC的措施。下一步可以考虑在酱油发酵中直接添加某种安全的化学物质抑制EC的合成或者研发可以降低EC的食品添加剂（如天然提取物），均可作为未来的研究热点及趋势[40]。另外，不仅要确保减除EC含量，更要保证酱油产品的感官品质、营养价值以及贮藏期等问题，往后进一步研究不同减除技术对其货架期的影响也是很有必要的。这些举措将有利于我国尽快建立有关发酵食品中EC的安全标准体系，同时也为酱油行业的发展保驾护航[41]。