Shh信号通路抑制剂环巴胺对裸鼠皮下人直肠癌移植瘤形成的影响

苏晋捷，姚城，刘晓平，卡达尔江，李天明，林荣杰，曾翔辉，王瑞，何安全

1克孜勒苏柯尔克孜自治州人民医院，新疆阿图什845350；2深圳市萨米国际医疗中心；3赣南医学院第一附属医院

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和病死率呈逐年上升趋势,目前手术是其主要治疗方法[1]。大多数结直肠癌患者就诊时已处于癌症进展期，部分患者失去手术机会，而部分患者术后出现复发及转移[2]。尽管辅助放化疗可延缓疾病进展，但其不良反应大，严重影响患者生活质量，且易导致患者死于各种并发症。目前结直肠癌的治疗还有待进一步提高，新的治疗手段如基因靶向治疗有望成为治愈的有效手段。研究显示，Shh信号通路在调控胚胎发育和干细胞分化中具有重要作用，其异常激活与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[3，4]。环巴胺是一种异甾体类生物碱，其抗肿瘤作用与Shh介导的Hedgehog信号通路有关，能够抑制肿瘤基因的转录与表达，进而抑制肿瘤形成[5，6]。其抗肿瘤作用在胰腺癌、前列腺癌等体内或体外实验中均得到证实[7，8]。Shh信号通路异常激活与结直肠癌相关[9，10]，然而环巴胺与结直肠癌的关系目前报道较少。2018年7～12月，我们观察了Shh信号通路抑制剂环巴胺对裸鼠皮下人直肠癌移植瘤形成的影响，旨在为直肠癌的靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与仪器 4～5周龄SPF级BALB/C-nu/nu裸鼠60只，雌雄各半，体质量15～18 g，由中山大学实验动物中心提供。HR8348人直肠癌细胞由中山大学细胞实验中心提供。Shh信号通路抑制剂环巴胺、水合氯醛(Sigma，美国)，PBS(Gibco，美国)。显微镜(奥林巴斯，日本)，细胞恒温培养箱及电热恒温干燥箱(杭州硕联，中国)。

1.2 细胞培养 取HR8348细胞，加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

1.3 动物分组与肿瘤移植、药物干预 将60只裸鼠随机分为对照组和同时给药组、延迟给药组，每组各20只。分别于裸鼠左后肢外侧皮下一次性注射1.0×106个HR8348细胞建立移植瘤模型。对照组建模后立即注射生理盐水0.2 mL；同时给药组建模后立即注射20 μmol/L环巴胺0.2 mL，1次/d；延迟给药组建模5 d后肉眼可见肿瘤长出，给予皮下注射20 μmol/L环巴胺0.2 mL，1次/d。

1.4 移植瘤形成情况观察 分别于给药10 d、20 d，三组各取10只裸鼠处死。取出肿瘤，用天平称量肿瘤质量，移植瘤质量抑制率=(1-给药组移植瘤质量/对照组移植瘤质量)×100%。选取移植瘤最大切面(横切面及纵切面)，用游标卡尺测量最大切面长(a)、宽(b)、高(c)，代入V=(πabc)/6计算移植瘤体积，移植瘤体积抑制率=(1-给药组移植瘤体积/对照组移植瘤体积)×100%。取肿瘤组织行常规HE染色，光镜下肿瘤细胞核大深染呈蓝紫色，异型性明显，判定为阳性细胞。随机观察5个高倍视野，计数阳性细胞数。移植瘤细胞密度=给药组阳性细胞数/对照组阳性细胞数×100%。

2 结果

所有裸鼠5 d后均成功长出肉眼可见的直肠癌移植瘤。两组给药10 d、20 d后的移植瘤体积、质量及细胞密度比较见表1。与延迟给药组相比，同时给药组10 d、20 d后的移植瘤体积抑制率、质量抑制率均升高，细胞密度均降低(P均<0.05)；与给药10 d后相比，两组给药20 d后的移植瘤体积抑制率、质量抑制率均升高，细胞密度均降低(P均<0.01)。

表1 两组给药10 d、20 d后的移植瘤体积抑制率、质量抑制率及细胞密度比较

3 讨论

手术是结直肠癌的主要治疗方法，但部分患者术后会出现复发及转移；辅助放化疗可延缓疾病进展，但不良反应大，严重影响患者生活质量，且易导致各种并发症。研究显示，多种信号转导途径在结直肠癌中呈激活状态，靶向抑制这些信号通路可能成为一种新的治疗结直肠癌的手段。Hedgehog基因是胚胎发育的一个关键调控靶点，它诱导哺乳动物精子和软骨的分化，神经系统、运动系统、消化系统、眼睛、皮肤的形成，以及与器官对称性发育相关，其异常激活与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[10]。研究表明，在结肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤中均存在Shh信号的异常激活[7，11]。

环巴胺是一种异甾体类生物碱，其抗肿瘤作用与Shh基因介导的Hedgehog信号通路有关，使肿瘤基因的转录与表达受到抑制，从而抑制信号通路的活性，抑制肿瘤形成的过程。本研究用人直肠癌细胞株HR8348建立裸鼠直肠癌移植瘤模型，分别于建模同时及肉眼可见移植瘤时注入环巴胺，观察环巴胺对裸鼠直肠癌移植瘤生长的影响。与对照组相比，同时给药组和延迟给药组的移植瘤体积抑制率、移植瘤质量抑制率均明显上升；连续给药20 d后，同时给药组和延迟给药组的移植瘤体积抑制率、质量抑制率明显高于连续给药10 d后。表明环巴胺可抑制裸鼠直肠癌移植瘤生长，随着用药时间延长，环巴胺对直肠癌移植瘤生长的抑制率越高。

研究表明，低分化癌组织中，低分化甚至未分化的肿瘤的细胞密度比例较高，其间可见部分坏死及液化区域，肿瘤细胞密度与细胞液化、坏死、以及细胞增殖密切有关，肿瘤细胞密度可反映细胞生长速度[12]。环巴胺具有抗肿瘤作用，可抑制多种肿瘤细胞的生长、转移和浸润。本研究结果显示，连续用药10 d后，同时给药组和延迟给药组移植瘤细胞密度小于对照组；连续用药20 d后，同时给药组和延迟给药组的移植瘤细胞密度小于对照组，且同时给药组较延迟给药组降低更明显。这表明不同时间皮下注射环巴胺，对移植瘤细胞生长的抑制效果不同，早期皮下注射环巴胺抑制效果更佳。提示环巴胺对肿瘤未形成时、肿瘤形成时均有抑制作用，既可用于术前的辅助治疗，也能用于晚期肿瘤患者的治疗或预防术后复发。

总之，环巴胺可抑制裸鼠直肠癌移植瘤生长，且随着用药时间延长，其抑制作用愈加明显。本研究的结果为进一步探讨环巴胺与直肠癌恶性行为关系提供了理论依据，也为直肠癌靶向治疗提供了新的靶标。