环氧合酶2抑制剂对非酒精性脂肪性肝病大鼠模型回肠Acsl基因家族表达的影响

郭 珊，易世杰，阳学风，曹 婷，傅 念，周克兵，龙建武

南华大学附属南华医院 消化内科，湖南 衡阳 421002

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精以及其他明确损肝病因引起的肝细胞内脂质过多的沉积为主要表现的世界最常见的肝疾病[1]。环氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)是一种诱导型酶，曹名波等[2]研究表明，COX-2能够诱导脂质过氧化反应，进而引起NAFLD，同时能够加重肝细胞的凋亡；应用COX-2抑制剂，使COX-2表达下调，进而抑制脂质过氧化反应，减轻脂肪肝的肝组织损伤。因此，COX-2对NAFLD有调控作用。有研究[3-8]表明，长链脂酰辅酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetases，Acsl)是酰基激活酶家族成员之一，其催化合成脂酰CoA，为哺乳动物利用脂肪酸合成各类脂质。在胚胎发育时期，肠道和肝组织是内在相互联系的。研究[9]表明，肠道和肝之间存在多层次的相互依赖关系，肠-肝轴紊乱与一系列肥胖相关疾病密切相关，NAFLD 患者肠道通透性较正常人明显增高。脂肪的吸收主要在小肠，小肠丰富表达Acsl基因。因此本实验旨在探讨COX-2抑制剂对NAFLD大鼠回肠Acsl基因家族表达的影响，进而明确COX-2是否能够通过调节回肠Acsl的表达从而影响NAFLD的发展，为NAFLD的发病机制和治疗新靶点的选择提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料 45只雄性SD大鼠，体质量(20±2)g，购自于上海西普尔-必凯实验动物机构有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016;实验动物使用许可证编号：SYXK(湘)2020-0002]。高脂饲料：80.5%基础饲料，10%蛋黄粉，7%猪油，2%胆固醇，0.5%胆盐(南通特洛菲饲料科技有限公司)。高脂饲料购于杭州赫贝公司。伊红、苏木精、油红O染液购自美国SIGMA公司，高纯总RNA快速提取试剂盒购自中国上海Generay公司，逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物饲养、分组及给药 45只SD雄性大鼠均在南华大学实验动物研究中心饲养，所有SD大鼠的饲料量全部以1015 g·100 g-1·d-1的标准进行喂养。适应性喂养1周后，将所有SD大鼠根据完全随机法分为3组，分别为：正常对照组(n=15只,普通饲料)；NAFLD模型组(n=15,高脂饲料)；尼美舒利组(n=15,高脂喂养8周后，予以尼美舒利6 mg·kg-1·d-1灌胃，连续4周)。SD大鼠全部按照之前的标准饲养，饲养到第12周处死。

1.2.2 实验观察和大鼠管理 饲养大鼠过程中观察各组大鼠的毛发、精神、营养状态、行为和食欲，严格按照相关规定处理及饲养所有大鼠。实验期间所用的笼具必须定期消毒、清洗，同时需要及时整理卫生、更换垫料、消毒喂养室，饲料必须经高压消毒后放到清洁准备间储存，储存时间不得超过15 d，保持饲养环境能够长期达标。

1.2.3 各组静脉血清学数据的测定 大鼠深度麻醉后，采取各组大鼠下腔静脉血，以3000 r/min，离心10 min，分离血清后迅速送到南华大学附属南华医院检验科，全自动生化分析仪检测各组大鼠静脉血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的数值。

1.2.4 肝组织病理学检查 4%多聚甲醛浸泡固定肝组织后，进行石蜡包埋切片，行HE染色。用4%多聚甲醛固定肝组织2～4 h后，包埋在OCT冰冻切片中，行肝脏油红O染色。该步骤在南华大学病理学教研室完成，需在普通光镜下观察切片情况并显微照相记录。

1.2.5 引物设计 Acsl1上游引物为5′-TGTGGTTCCGAGACTGCTA-3′，下游引物为5′-AGGCTGTTGTTTCTGACGAT-3′，片段长度为141 bp；Acsl3上游引物为5′-GGCTGAGTGGATGATTGCTG-3′，下游引物为5′-GGCTGAGTGGATGATTGCTG-3′，片段长度为128 bp；Acsl4上游引物为5′-TGGCTACTTACCTTTGGCTCAT-3′，下游引物为5′- TCACCCTTGCTTCCCTTCT-3′，片段长度为138 bp；Acsl5上游引物为5′-AACCAGTCTGTAGGGATTGAGG-3′，下游引物为5′- GGCGTCTGAGAAGTAATAAAGGAT-3′，片段长度为87 bp；Acsl6上游引物为5′-CAGTTGCTTACCCACTACTATGACG-3′，下游引物为5′-CCACCTCTTGATAGGACAGCC-3′，片段长度为87 bp；COX-2上游引物为5′-TCAGCCATGCAGCAAATCCTT-3′，下游引物为5′ -CCGTAGAATCCAGTCCGGGT-3′，片段长度为112 bp。

1.2.6 qPCR 检测回肠Acsl的表达 Trizol-离心柱法提取总RNA，测定 RNA纯度和RNA定量，取总RNA 2 μg在逆转录作用下反转录为cDNA，以此为模板，按以下程序进行PCR反应扩增:50 ℃ 3 min，95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，35循环。qPCR结束后，制作溶解曲线，反应条件为72 °C 20 s，从70 ℃开始到95 °C，每增加0.5 ℃，保持5 s，读取吸光值。取5 μl扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，实验结果由荧光定量PCR分析软件BIO-RAD CFX Manager自动统计和计算，最后依照实验数据进行统计，并根据2-ΔΔCt值绘制各样品目的基因的相对定量直方图。

1.3 伦理学审查 本研究方案经由南华大学附属南华医院实验动物伦理委员会审批(批号：20201938)，符合实验室动物管理与使用准则。

2 结果

2.1 一般情况 饲养大鼠过程中，观察到对照组大鼠毛发光泽，营养状态良好，反应迅速，食欲佳，无攻击性。而NAFLD模型组的大鼠毛发逐渐失去光泽，营养状态欠佳，反应迟钝，食欲欠佳，个别有攻击性。与NAFLD模型组大鼠比较，尼美舒利组的大鼠的毛发色泽、营养状态、反应以及食欲均有明显改善。正常对照组、NAFLD模型组、尼美舒利组适应性喂养1周后，按照各组喂养方式至12周。喂养0、4、8、12 周时正常对照组小鼠体质量分别为：(20.81±1.95)g、(24.65±3.86)g、(26.52±2.89)g、(28.47±3.18)g；NAFLD模型组小鼠的体质量分别为：(21.18±2.38)g、(26.21±3.45)g、(30.86±3.62)g、(32.78±3.77)g；尼美舒利组小鼠的体质量分别为：(21.96±3.06)g、(25.39±2.42)g、(30.53±2.88)g、(24.78±3.66)g。

2.2 各组大鼠TG、TC的比较 与对照组大鼠相比，NAFLD模型组大鼠血清TG、TC值均增加，且差异有统计学意义(P值均<0.05)。而与NAFLD模型组相比，尼美舒利组大鼠血清TG、TC值均下降，且差异有统计学意义(P值均<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠血清TG、TC结果(mmol/L)

2.3 肝脏HE染色分析及镜下诊断 正常对照组：肝细胞排列规则，肝细胞核大小形态正常。肝组织、肝小叶结构完整无破损，未见炎症细胞浸润、肝脂肪变性、纤维间隔形成(图1)。NAFLD模型组：肝细胞排列不规则，中央静脉缺如，可见各细胞变大变圆，细胞气球样改变，大量不同大小的脂肪滴。肝组织结构破坏明显，可见纤维间隔、假小叶、大量坏死及炎症细胞浸润、明显肝脂肪变性(图2)。尼美舒利组：肝细胞排列尚规则，细胞轻度肿胀，可见数个直径较小的脂滴，肝小叶结构基本正常，未见假小叶和纤维间隔(图3)。

2.4 肝脏油红O染色分析及镜下诊断 正常对照组：细胞边界清晰，细胞质丰富不显色，细胞核膜完整无破坏，细胞核为深蓝色，无红色脂滴(图4a)。NAFLD模型组：细胞边界模糊，整个视野可见脂肪颗粒，表现为大小不等的红色斑点，期间可见散在深蓝色的细胞核(图4b)。尼美舒利组：细胞边界尚完整，整个视野可见少量红色脂肪颗粒，红色颗粒与NAFLD模型组比较明显减少，可见少许散在深蓝细胞核(图4c)。

2.5 qPCR法检测回肠COX-2及Acsl家族基因的基因表达情况 与正常对照组大鼠相比，NAFLD模型组大鼠回肠COX-2的表达明显升高(P<0.05)；与NAFLD模型组大鼠相比，尼美舒利组回肠COX-2的表达明显降低(P<0.05)。与正常对照组相比，NAFLD模型组回肠Acsl3、Acsl5基因的表达明显增加(P值均<0.05)；与NAFLD模型组相比，尼美舒利组Acsl3、Acsl5基因的表达明显降低(P值均<0.05)(表2)。

3 讨论

NAFLD主要由肥胖、胰岛素抵抗、遗传易感性和线粒体、内质网的氧化应激导致[10]。早期NAFLD患者无明显临床症状[11]。在NAFLD 病情发展中，脂肪堆积过多，肝细胞发生变性、坏死，最终可形成肝纤维化，导致肝硬化[12-13]。NAFLD也是西方国家最常见的慢性肝病病因，预计到2030年NAFLD将成为肝移植最常见的适应证[14]。NAFLD 主要发生于肥胖人群，与代谢综合征及糖尿病的发生发展密切相关。随着生活质量的不断提高，发病率逐年上升，严重危害人类健康，治疗和预防越来越引起人们的重视。NAFLD 发病机制十分复杂，尚未完全明确，近年来对发病机制的认识由“二次打击学说”逐渐向“多重打击模型”转变[15]。目前，许多研究多集中在阐明NAFLD发生发展的相关因素，这些相关因素被称为“多重平行打击”，它们能够促使肝脂肪变向更复杂更严重的NAFLD病程进展[16]。这些相关因素包括：肠道菌群失调[17]、饮食结构改变[18]、肠道通透性变化[19]、相关基因改变[20]、内质网应激反应[21]以及相关信号通路活化等[22]。

表2 各组回肠中COX-2、Acsl1、Acsl3、Acsl4、Acsl5、Acsl6基因的表达水平

COX-2是一种诱导型酶，正常情况下，大部分组织不表达COX-2，只有在各种炎症因子及癌基因等刺激下才会表达。脂质在回肠消化吸收过多引起脂肪代谢紊乱，诱导毒性脂代谢产物沉积与活性氧化物质生成过多，引起炎症反应，从而使COX-2表达增加。同时，COX-2能够加重脂质过氧化反应，诱导肝细胞的凋亡从而引起NAFLD。应用COX-2抑制剂，可以抑制脂质过氧化反应，进而缓解脂肪肝的脂肪变性和肝细胞损伤[23]。有研究[24]表明，小肠黏膜受损状况下，COX-2的表达增加，且与炎症程度呈正相关。同时有实验[25]发现，炎症小肠上皮COX-2水平较正常小肠上皮明显增加，而经槲皮素处理后小肠黏膜损伤情况好转，其COX-2表达明显降低。本研究结果表明：与正常对照组比较，NAFLD模型组回肠COX-2表达明显升高，与NAFLD模型组比较，尼美舒利组大鼠回肠上COX-2表达明显降低。NAFLD的回肠COX-2呈高表达，说明COX-2参与回肠脂质反应，应用COX-2抑制剂尼美舒利后，可以改善肝组织损伤、减轻肝脂肪变性。

Acsl家族基因有5个亚型，分别为Acsl1、Acsl3、Acsl4、Acsl5、Acsl6，这5种基因在组织特异性以及底物特异性上都存在一定区别，但都具有相同的催化作用：催化游离脂肪酸合成脂酰CoA[26]，参与TG的合成。Acsl3作为长链脂酰CoA合成酶家族中的一员，主要生理功能是调节细胞内脂质代谢，催化长链脂肪酸激活的第一步，参与脂质合成和蛋白质修饰。有研究[27]发现，Acsl3在高脂饲养大鼠模型肝组织中呈高表达，且血中TG、游离脂肪酸明显升高；抑制Acsl3表达后，脂酰CoA合成酶活性降低，最终使肝脏脂质沉积减少，说明下调Acsl3的表达可以改善肝纤维化。Bauer等[28]研究证实，通过下调小肠上依赖Acsl3诱导的脂质合成，加氏乳杆菌能够减少肠道脂质代谢，改变肠道内环境，说明抑制小肠Acsl3可以减少脂质合成。Acsl5作为长链脂酰CoA合成酶家族中的一员，丰富表达于小肠，参与脂质合成和分解代谢。Reinartz等[29]研究证实，脂肪肝的大鼠可上调Acsl5的表达，脂肪酸的摄取增多，TG合成增加，抑制肝细胞增殖，促进肝细胞凋亡。有研究[29]表明，棕榈酸或油酸能够使肝星状细胞中Acsl1、Acsl5、Acsl6的表达上调，而应用COX-2后能拮抗棕榈酸或油酸诱导的Acsl5、Acsl6表达上调，从而抑制肝星状细胞脂化，促进其活化而引起肝纤维化。

小肠是脂质吸收的重要场所，本研究发现，COX-2在NAFLD大鼠回肠末端高表达，其可能通过促进回肠过多的脂质消化吸收引起脂肪代谢紊乱。COX-2有调控Acsl家族某些基因的作用。本课题组前期实验[8]已证明，COX-2能通过调节肝星状细胞上Acsl1、Acsl4、Acsl6的表达，从而改变肝星状细胞的活性，参与NAFLD的发生发展。同时有研究[30]表明，尼美舒利对COX-2的抑制作用抑制了肝脏炎症和纤维化发生，并降低了NAFLD的胰岛素抵抗。本实验通过qPCR法检测回肠Acsl3及Acsl5的表达情况，结果表明，NAFLD模型组与正常对照组相比，回肠Acsl3、Acsl5的表达显著增加，而与NAFLD模型组相比，尼美舒利组回肠Acsl3、Acsl5的表达显著下降。因此推断：Acsl3、Acsl5参与回肠脂质代谢，COX-2在回肠末端可能通过启动Acsl3及Acsl5参与脂质合成的作用，从而参与NAFLD的发生发展，COX-2抑制剂尼美舒利可能通过下调回肠Acsl3、Acsl5的表达，改善脂肪肝大鼠的肝脏脂肪变和纤维化，但其中具体机制还需组进一步研究。

本实验结果同时显示，NAFLD模型组与正常对照组相比，Acsl1、Acsl4、Acsl6表达均无明显变化，尼美舒利组与NAFLD模型组相比，Acsl1、Acsl4、Acsl 6的表达均无明显变化，因此可知，Acsl1、Acsl4、Acsl6在脂肪肝小鼠和正常小鼠的回肠上表达无明显变化，回肠上Acsl1、Acsl4、Acsl6可能不参与NAFLD的过程，Acsl1、Acsl4、Acsl6可能通过其他途径参与NAFLD的进展。

本实验表明，尼美舒利可以下调脂肪肝大鼠回肠Acsl3、Acsl5的表达，其具体作用机制尚待进一步研究证实。更深入地研究COX-2抑制剂与回肠Acsl3、Acsl5的功能及其调控关系，可对探索NAFLD治疗靶点提供新的途径。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：郭珊、易世杰、曹婷、阳学风负责课题设计，资料分析，撰写论文；郭珊、傅念、周克兵、龙建武参与收集数据，修改论文；阳学风负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。