宫颈癌NY-ESO-1特异性T细胞免疫反应分析

袁源亮， 刘 凯， 冯亚宁， 王若峥

(新疆医科大学1第三临床医学院，2附属肿瘤医院放疗中心， 乌鲁木齐 830011； 3新疆肿瘤学重点实验室， 乌鲁木齐 830011；4中国医学科学院肿瘤免疫与放疗研究重点实验室， 乌鲁木齐 830011)

宫颈癌(cervical cancer, CC)如今仍然是妇女最常见的癌症之一，根据国际癌症研究机构的数据，其发病率和死亡率都排在第四位[1-2]。研究发现，大多数宫颈癌病例是由人乳头瘤病毒(HPV)引起[3]。在现有的新疗法中，免疫疗法为复发和转移性宫颈癌的妇女带来了希望[4]。如今，越来越多的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA)被发现，其中CTA被认为是癌症免疫治疗的良好候选靶点，因为它们的特点是在正常的细胞中有限制表达，同时在多数实体肿瘤中有过表达[5]。NY-ESO-1在CTA家族成员中免疫原性较强，能够诱导特异性T细胞免疫反应，由于它在肿瘤中的高表达并诱导相关免疫反应，被认为是目前最有希望用于免疫干预的CTA[6-7]。ICS是用流式细胞术量化T细胞反应性的的方法，能同时检测单个细胞的表型及其在短期孵育过程中刺激后产生的细胞因子，可以进行多参数分析[8]。但是，目前对NY-ESO-1的研究在宫颈癌中鲜有报道，且尚未有使用ICS技术开展对宫颈癌的检测。因此，本研究建立了九色流式胞内细胞因子染色方案，同时检测多种细胞因子，对比分析宫颈癌患者NY-ESO-1特异性T细胞免疫应答差异及其临床相关性，为宫颈癌的免疫治疗研究的开展提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2018年8月-2019年6月新疆医科大学附属肿瘤医院收治的35例宫颈癌初治患者。纳入标准：(1)首次经病理明确诊断且未接受治疗的宫颈癌初治患者；(2)KPS评分≥70分者；(3)有完整的临床病例资料者。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤病史者；(2)急性或慢性感染性疾病者；(3)合并免疫系统疾病者；(4)实验失败者。根据纳入标准及排除标准进行筛选，最终符合入组条件的宫颈癌患者31例。宫颈癌患者年龄37～83岁，中位年龄52岁；依据WHO病理分型，鳞癌29例，腺癌1例，肉瘤样癌1例；依据国际妇产科联盟(FIGO)2018年宫颈癌分期，I-II期15例，III-IV期16例。

1.2 材料

1.2.1 主要试剂 NY-ESO-1抗原肽由英国牛津大学MRC人类免疫学实验室馈赠，淋巴细胞分离液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)、RPMI-1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、Live/Dead染料BV510、流式细胞仪鞘液、FACS溶液、小鼠抗人单克隆抗体细胞表面标记物(CD3-BV786、CD4-PE-CY7、CD8-BB700)、细胞因子抗体(IFN-γ-AF488、TNF-α-BV650、IL-2-BV421、IL-13-APC、MIP-1β-PE)均购于BD公司。

1.2.2 主要仪器 流式细胞分析仪(BD公司)；生物安全柜(NuAire公司)；CO2培养箱(Thermo Fisher公司)；台式低温离心机(Thermo Fisher公司)；96孔培养板(Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1 NY-ESO-1抗原肽体外诱导特异性T细胞 宫颈癌患者入院在未行任何治疗前抽取肘静脉血15 mL(EDTA抗凝)，用密度梯度离心法分离PBMCs。取0.4×106/L PBMCs细胞重悬于50 μL R20(含20%FBS的RPMI-1640培养基)中，再加入50 μL浓度为10 μg/mL NY-ESO-1抗原肽共培养，37℃孵育60～90 min；用2 mL R10(含10%FBS的RPMI-1640培养基)清洗细胞，弃上清，重悬至含100μL H10(10%人AB血清)的96孔培养板中，37℃、5% CO2培养箱中培养72 h后加入100 μL含400 IU的IL-2+H10中，隔天换液1次，每次吸出培养上清液100 μL，再加入100 μL 200IU的IL-2+H10培养至10～12 d时洗涤后混匀，将细胞分为2份，每份各200 μL。

1.3.2 胞内细胞因子染色(ICS) 培养至第10日，1 500 rpm/min离心5 min后弃上清，加入不含谷氨酰胺的R10洗涤并离心2次，加100 mL R20后等分为2孔，实验孔(抗原肽刺激者，即Positive者)加入NY-ESO-1抗原肽进行刺激，对照孔(IL-2维持者，即Negative者)则加入RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO2培养箱中孵育1 h后加入蛋白转运抑制剂进行阻断，继续孵育4 h后进行细胞表面分子染色、破膜、固定、胞内细胞因子染色、重悬，每一步骤之间均用FACS溶液进行洗涤2次。

1.3.3 流式细胞术检测T细胞杀伤活性 使用多色流式细胞仪BD FACS Fortessa上机分析，对所有存活的CD3+T淋巴细胞中的CD4+T和CD8+T细胞进行了门控，检测Positive组和Negative组中所有门控T细胞中单独或多重分泌IFN-γ、IL-2、IL-13、MIP-1β、TNF-α细胞因子产生细胞的百分比。采用FlowJo10.6对所得细胞亚群及细胞因子流式数据进行分析。

1.4 结果的判定标准参考本实验之前Elispot的经验和国外一些细胞因子分泌判定方法[9-10]，规定对于每种细胞因子，如果Positive者-2×Negative者-0.05%≥0，则将抗原反应性T细胞定义为阳性；而Positive者-2×Negative者-0.05%<0时将抗原反应性T细胞定义为阴性，取值设置为0。

1.5 统计学分析应用IBM SPSS 25.0软件进行统计分析，使用GraphPad Prism 8.0软件绘制统计图。计数资料使用百分比表示，NY-ESO-1抗原肽刺激的特异性T细胞免疫反应阳性频率与一般临床特征间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌患者NY-ESO-1特异性T细胞免疫反应频率分析1例宫颈癌患者外周血中的流式细胞分析，见图1。宫颈癌患者外周血对NY-ESO-1抗原肽刺激产生免疫应答率为67.4%(21/31)，其中CD4+T细胞免疫应答阳性率为32.3 %(10/31)，CD8+T细胞免疫应答阳性率为54.8%(17/31)，见图2。

图1 1例宫颈癌患者外周血中CD4+、CD8+T细胞分泌细胞因子流程图

图2 31例宫颈癌患者NY-ESO-1特异性T细胞免疫反应频率

2.2 NY-ESO-1特异性T细胞分泌细胞因子模式分析宫颈癌患者外周血中CD4+和CD8+T细胞对NY-ESO-1抗原肽的5种功能反应结果见图3，沿着X轴列出了分泌IFN-γ+、IL-2+、IL-13+、MIP-1β+、TNF-α+的31种可能组合，红色和蓝色条分别表示宫颈癌患者31种可能组合中每种组合的CD4+和CD8+T细胞对NY-ESO-1抗原肽的反应频率。X轴下方的5个不同颜色的水平条表示5个、4个、3个、2个、1个功能反应的群体。结果显示，宫颈癌患者CD4+和CD8+T细胞反应频率的1个功能反应群体明显高于2～5个功能反应群体。31例宫颈癌患者外周血中CD4+和CD8+T细胞分泌5种细胞因子的百分比散点图，见图4。

2.3 宫颈癌患者NY-ESO-1特异性T细胞免疫应答与临床特征宫颈癌患者无流产史者NY-ESO-1特异性CD4+T细胞免疫反应阳性率明显高于有流产史者，分别为63.6%、15.0%，二者差异有统计学意义(P=0.018)； 而在年龄、家族史、绝经史、流产史、肿瘤大小、肿瘤大体类型、组织病理类型、肿瘤分化程度、FIGO分期、HPV感染、SCC、盆腔淋巴结转移间差异无统计学意义。宫颈癌患者≤52岁者NY-ESO-1特异性CD8+T细胞免疫反应阳性率明显高于>52岁者，分别为70.6%、35.7%，二者统计学差异为临界值(P=0.052)；而在家族史、绝经史、流产史、肿瘤大小、肿瘤大体类型、组织病理类型、肿瘤分化程度、FIGO分期、HPV感染、SCC、盆腔淋巴结转移间差异无统计学意义，见表1。

图3 宫颈癌患者外周血中T细胞的5种功能反应结果

图4 特异性T细胞反应分泌细胞因子概况

表1 宫颈癌NY-ESO-1特异性T细胞免疫反应频率与临床特征的关系

3 讨论

NY-ESO-1基因定位于X染色体的Xq28区域，最初是Chen等[9]通过用食管癌患者的自体血清筛选肿瘤来源的cDNA表达文库来描述食管癌的，是新基因家族的第一个成员，被鉴定为一种能诱导高效价IgG体液反应的肿瘤抗原。之后的研究证实NY-ESO-1也可以诱导细胞免疫反应，Jger等[10]首次报道在1例转移性黑色素瘤患者中对NY-ESO-1的体液和细胞免疫反应可能同时发生。NY-ESO-1在正常组织中的表达局限于生殖细胞和胎盘细胞[11]，而在多种肿瘤中有广泛表达，包括脂肪肉瘤(88%)[12]、神经母细胞瘤(82%)[13]、黑色素瘤(45%)[14]、卵巢癌(43%)[15]、食管癌(41.4%)[16]等，使得NY-ESO-1成为脱靶毒性有限的靶点，在多种癌症类型中具有广泛的应用前景，强调了它作为特定免疫治疗程序靶点的高度潜在相关性，因此NY-ESO-1可以作为肿瘤免疫治疗的理想靶点之一。

NY-ESO-1在多种实体肿瘤中的研究相继开展，使用ICS技术研究报道较少。以往研究大多数使用ELISA试验、免疫组织化学方法等，上述方法只能对单一细胞因子表达进行检测，且无法明确单细胞水平多种细胞因子的共表达水平，无法对双重乃至多重细胞因子分泌的T细胞亚群进行分析。ICS技术依赖于在刺激后不久向细胞中添加蛋白质分泌抑制剂，这使得细胞因子可以保留在抗原特异的细胞内，以便随后用荧光抗体进行细胞因子和细胞标志物的染色，与其他方法相比，细胞因子保留在细胞内不仅可以加速它们的检测，而且还可以鉴别与此功能相关的特定细胞群[8]。

为了评价NY-ESO-1抗原作为宫颈癌特异性免疫治疗靶点的价值，本研究对NY-ESO-1抗原肽刺激宫颈癌患者外周血产生的特异性T细胞免疫反应进行了综合分析。在宫颈癌中，Sarcevic等[17]报道通过免疫印迹和免疫细胞化学方法，经NY-ESO-1/LAGE-1特异性试剂染色后，可以在较小的样本系列中检测到频率相当的阳性反应(7/11，63.6%)。其次Napoletano等[18]应用免疫组织化学方法对162例接受根治性子宫切除术、新辅助化疗或盆腔疾病复发患者的宫颈癌标本进行分析后发现，宫颈癌常表达肿瘤睾丸肿瘤相关抗原，与肿瘤预后相关，早期肿瘤中NY-ESO-1与肿瘤分级相关，NY-ESO-1的表达率不受系统治疗的影响。本课题组既往用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测NY-ESO-1抗原肽刺激食管鳞癌患者PBMCs分泌IFN-γ的特异性CTL(细胞毒性T淋巴细胞)反应频率为19.6%(10/51)，其在食管鳞癌临床特征中的差异无统计学意义[19]，本研究采用ICS技术，分析了NY-ESO-1抗原肽刺激宫颈癌初治患者外周血产生的特异性T细胞免疫反应，免疫应答阳性率为67.4%，较前增加，提示ICS技术可检测到NY-ESO-1能在宫颈癌中表达，具有免疫原性，有成为宫颈癌免疫治疗靶点的可能。针对该抗原的免疫治疗在涉及NY-ESO-1表达肿瘤的临床试验中显示出一些希望，特别是在滑膜肉瘤和恶性黑色素瘤中[20-22]。

有研究显示，有流产史以及2次或2次以上的剖腹产史等是高级别CIN的重要危险因素，高龄是高级别CIN的统计学显著因素，宫颈癌筛查应特别关注具有上述危险因素的妇女，缩短筛查间隔时间[23]。其次，对病毒感染产生CD8+T细胞反应的能力随着年龄的增长而显著变化[24]，Avelino-Silva等[25]回顾近20年来的文献发现HIV感染中导致CD4+和CD8+T细胞耗尽的慢性免疫激活随着年龄的增长而恶化，Murasko等[26]发现老年小鼠IFN-α/β、IFN-γ和/或IL-12水平的变化，加上T细胞的内源性改变，可能导致老年小鼠体内病毒特异性CD8+T细胞数量的减少和病毒清除的延迟。在本研究中，NY-ESO-1特异性T细胞免疫反应阳性率与患者临床特征(家族史、绝经史、肿瘤大小、肿瘤大体类型、组织病理类型、肿瘤分化程度、FIGO分期、HPV感染、SCC、盆腔淋巴结转移)之间分组比较中，差异无统计学意义，其中无流产史患者NY-ESO-1特异性CD4+T细胞免疫反应阳性率明显高于有流产史患者，二者差异有统计学意义(P=0.018)；≤52岁患者NY-ESO-1特异性CD8+T细胞免疫反应阳性率明显高于>52岁患者，二者统计学差异为临界值(P=0.052)，表明有无流产史和年龄的差异可能是导致NY-ESO-1特异性抗原多肽反应差异的原因之一，但也有可能是因为本研究病例数少，需进一步研究探索导致其差异的根本原因。提示，在今后的免疫治疗中，为保证无流产史和年轻宫颈癌患者的治疗效果，应增加提高免疫的相应治疗。

综上所述，本研究通过探索宫颈癌中NY-ESO-1特异性T细胞免疫反应差异与临床特征之间的联系，为今后NY-ESO-1作为宫颈癌免疫治疗的靶点提供一定实验室依据及线索，但仍需扩大样本量进行深入研究。