不同组分植物甾醇对瘤胃发酵参数的影响

吴子辰，薛天涵，吕东海，成艳芬，朱伟云

(南京农业大学消化道微生物实验室，江苏 南京 210095)

近些年随着社会逐渐稳定，人们生活水平进一步提高，养殖业的重心从提高动物生长性能、生产效益逐渐转为关注动物健康、饲料安全以及畜产品品质等方面。植物甾醇是一种新型功能性绿色饲料添加剂，属于植物性甾体化合物，具有植物活性成分[1]。自然界中存在的植物甾醇分为游离型和酯化型，酯化型的植物甾醇更易溶于有机溶剂，其吸收利用率比游离型高约5倍，其功能作用也更加广泛[2]。明珠等[3]报道在大鼠饮食中加入一定量的植物甾醇可以有效降低血液中胆固醇含量，预防心脑血管疾病，保护肝脏和血管。近年来，人们又发现植物甾醇具有抗炎、抗癌、抗氧化的作用，并且具有很高的安全性[4]。目前，植物甾醇已广泛应用于食品、药品、化妆品等行业，并也应用于农业上。植物甾醇在水产、禽类、单胃动物上的研究发现，适宜的添加量可以降低体内胆固醇含量，改善动物体质，提高生产效率进而提高经济效益[5-6]。谢心美等[7]在奶牛中的研究也发现，在日粮中添加200 mg/d植物甾醇可显著提高奶牛的泌乳量，缩短首次参配时间和空怀时间，改善奶牛体质。

植物甾醇包括β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等，其组分不同，各甾醇含量和比例也不同。本研究旨在比较不同组分植物甾醇对瘤胃发酵的影响，为植物甾醇在反刍动物中的应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验所用5个植物甾醇样品由南京诺齐生物科技有限公司提供，植物甾醇含量均>90%，不同植物甾醇样品植物甾醇组分含量不同(表1)，分别标记为甾醇A～E。

表1 不同组分植物甾醇产品成分表 %

每个甾醇样品分3个梯度浓度进行瘤胃液体外发酵。3个浓度梯度分别为0.03、0.1、0.2 μg/mL，不添加植物甾醇作为试验对照组。发酵底物为600 mg全混合日粮。

参照文献[8]的方法配置人工瘤胃培养液，将4层纱布过滤后的瘤胃液与人工瘤胃营养液以1∶5体积比混合，总体积60 mL分装于120 mL发酵瓶内，39 ℃恒温培养24 h。分别于3、6、9、12、24 h测定产气量。发酵结束时，立即测定发酵液pH值，取发酵液-20 ℃冷冻保存用于测定微生物蛋白、乳酸、氨态氮、挥发性脂肪酸含量。发酵底物65 ℃烘干，称重用于计算底物干物质降解率。

1.2 指标测定

参照文献[9]的方法测定产气量，底物干物质降解率的测定参照文献[10]的方法，将发酵瓶内物质固液分离的同时洗涤发酵瓶中的残渣并将其与对应样品混合后在65 ℃烘干48 h，称重并根据差量法计算样品干物质降解率。体外发酵结束后培养液乳酸浓度的测定参照文献[11]的方法，微生物蛋白浓度的测定参照文献[12]的方法，氨态氮浓度的测定采用文献[13]的苯酚-次氯酸钠比色法，挥发性脂肪酸测定方法参考文献[14]的方法，包括测定总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸。

1.3 数据统计与分析

试验数据经Excel初步整理后，利用SPSS 21.0统计软件进行双因素方差分析和显著性检验，多重比较采用Duncan法。试验结果以“平均值±标准误”表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 不同组分植物甾醇对乳酸浓度的影响

通过对整体甾醇添加量分析(表2)，发酵结束时添加植物甾醇的试验组乳酸浓度与对照组相比均有所降低，浓度为0.03 μg/mL的B甾醇组乳酸浓度最低(0.17 mmol/L)。

2.2 不同组分植物甾醇对发酵产气量的影响

不同组分植物甾醇对瘤胃体外发酵各时间点产气量的影响见图1。随着发酵持续进行，累积产气量呈逐渐上升的趋势。各时间点各组产气量均高于对照组。24 h发酵终止时，浓度为0.03 μg/mL的B甾醇组累积产气量最高(57.33 mL)，对照组最低(38.07 mL)。

图1 不同组分植物甾醇对瘤胃体外发酵产气量的影响

2.3 不同组分植物甾醇对发酵液pH值、氨态氮、微生物蛋白以及干物质降解率的影响

表2显示了添加植物甾醇对瘤胃体外发酵各项指标的影响。甾醇浓度对pH变化影响显著(P<0.05)，试验组发酵液pH均比对照组低，且各组的pH均保持在正常范围内。甾醇组分和浓度对发酵液pH没有显著交互作用(P>0.05)。甾醇浓度对产气量的影响显著(P<0.05)，其中添加浓度为0.03 μg/mL组平均总产气量最高，0.2 μg/mL组最低，组分和浓度对体外发酵总产气量有显著的交互作用(P<0.05)。甾醇浓度对乳酸浓度影响显著(P<0.05)，甾醇组分和浓度对发酵液乳酸浓度交互作用不显著(P>0.05)。甾醇种类对发酵液氨态氮浓度有显著影响(P<0.05)，D组浓度最高，A组其次，B组最低且显著低于D组和A组(P<0.05)。甾醇组分和浓度对发酵液氨氮浓度没有显著交互作用(P>0.05)。发酵24 h时，甾醇浓度对发酵液微生物蛋白浓度影响显著(P<0.05)；C组添加植物甾醇为0.1和0.2 μg/mL时，微生物蛋白浓度显著高于0.03 μg/mL(P<0.05)。甾醇组分和浓度对发酵液微生物蛋白浓度有显著的交互作用(P<0.05)。通过对干物质降解率对比可以看出，甾醇组分对发酵液干物质降解率有显著影响(P<0.05)，对A组影响最大，其次是B组。甾醇浓度对发酵液干物质降解率影响显著(P<0.05)，其中0.03 μg/mL组平均干物质降解率最高。甾醇组分和浓度对发酵液干物质降解率有显著的交互作用(P<0.05)。

表2 植物甾醇对瘤胃发酵参数的影响

2.4 不同组分植物甾醇对微生物代谢产物的影响

不同组分植物甾醇对瘤胃体外发酵挥发性脂肪酸浓度的影响见表3。甾醇浓度对总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸以及乙酸/丙酸影响显著(P<0.05)，其中0.03 μg/mL组总挥发性脂肪酸、丙酸和丁酸显著高于其他浓度以及对照组(P<0.05)，添加浓度为0.03 μg/mL的B甾醇组丙酸浓度最高，为20.05 mmol/L，乙酸/丙酸3个浓度梯度组均显著高于对照组(P<0.05)。甾醇组分也可以显著影响乙酸/丙酸(P<0.05)，乙酸/丙酸最高的是D组，显著高于最低组B组(P<0.05)。甾醇组分和浓度只对乙酸/丙酸有显著的交互作用(P<0.05)。

表3 植物甾醇对瘤胃体外发酵挥发性脂肪酸的影响

3 讨论

反刍动物消化道功能结构与单胃动物有着很多的不同之处，适用于单胃动物的饲料添加剂种类与添加量并不一定同样适用于反刍动物。植物甾醇本身吸收率比较低，一般以乳糜微粒的形式被畜体吸收。自然来源的植物甾醇都是混合的，其本身是疏水性的，并倾向于形成稳定的晶体[15]。相比之下，纯化后的利用率会提高一些。脂肪在瘤胃中消化很重要的一部就是加氢酯化，酯化的方式能够提高植物甾醇生物利用率，大量的研究证据表明,容易被酯化的各种植物甾醇更容易被肠道吸收[16]。由此推测植物甾醇可能会对瘤胃发酵产生一些影响。由于植物甾醇在纯化时不会溶解而且无生物活性，因此需要特别注意确保通过脂肪溶解或乳化使商业补充剂产品具有生物可利用性[17]。

体外发酵产气量是判断瘤胃发酵功能优劣的重要指标之一，往往较高的产气量意味着更彻底的消化[18]。本试验多个试验组的产气量均显著高于对照组，并且不同甾醇浓度产气量也有变化，这与先前类似的试验结果一致[19]。干物质降解率和产气量相似，都可以反映体外瘤胃消化的程度，添加0.03 μg/mL植物甾醇会使干物质降解率有所提升，但添加植物甾醇的量有一定范围，过多可能会产生负面影响，在干物质降解率上可能存在剂量抑制性。

瘤胃pH是评定瘤胃发酵功能的一项重要生理指标，在正常饲喂条件下，瘤胃内的pH应保持在5.8～6.8，低于5.5时即可诊断为瘤胃酸中毒[20]。本试验结果显示，到24 h发酵结束时，试验各组pH值均显著低于对照组，但都控制在6.2以上，没有超出正常范围，并不会对瘤胃本身产生有害的影响。可能大部分微生物得到了充足的能量供应，使其生长速度大幅度提高，瘤胃中总挥发性脂肪酸的浓度升高，pH下降[21]。

挥发性脂肪酸是反刍动物瘤胃发酵的主要产物之一，可以将含氮化合物降解为氨，是反刍动物生产与维持最主要的能量组分，用于合成脂肪或者转化成其他物质提供能量[22]。瘤胃动物正是以挥发性脂肪酸提供能量的方式充分利用人类不能利用的纤维类物质。本试验结果显示，甾醇处理组的总挥发性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸以及乙酸/丙酸与对照组相比均有所提升，而这也可能导致了pH值的下降。

氨态氮可以反映出饲料中蛋白质的降解效率，是微生物蛋白的合成必不可少的原料，其浓度必须保证在一个适宜的范围内，否则会影响微生物的生物活性。有研究表明其最适浓度应该保证在10～50 mg/dL[23]。本试验氨态氮浓度始终保持在14 mg/dL左右，处于合适的浓度范围，且上下浮动很小。在本试验中氨态氮浓度只与甾醇种类有显著相关性，其中B组甾醇最低。微生物蛋白是反刍动物最主要的氮源供应者，其浓度反映了瘤胃利用氨态氮的能力，可以满足反刍动物蛋白质需要的40%～80%。添加0.1 μg/mL植物甾醇的组别氨态氮水平最低，0.03 μg/mL组最高，而微生物蛋白呈现的结果却与之相反，可能氨态氮是作为菌体蛋白合成的氮源，经瘤胃微生物转化成微生物蛋白，并存在一定剂量范围，在此范围内才能保证瘤胃微生物的正常生长，维持动态平衡。

乳酸是瘤胃发酵产生挥发性脂肪酸的中间产物，通常在瘤胃中的含量不高，其解离常数(3.9)远小于挥发性脂肪酸的解离常数(4.8)，乳酸对瘤胃pH值的贡献率为挥发性脂肪酸的近10倍[24]。人们通常认为挥发性脂肪酸含量越高，乳酸含量则越低，瘤胃乳酸在瘤胃中的累积导致瘤胃pH值急剧下降，引起机体代谢紊乱，多余的乳酸会随血液扩散全身，危及动物健康。本研究中甾醇处理组乳酸含量均明显下降，B组下降幅度最大，表示植物甾醇可能具有降低乳酸含量促进其转化为挥发性脂肪酸的功效。

一些研究表明β-谷甾醇由于其C-24位基团的碳原子数目较多与菜油甾醇相比不易被动物吸收，其双键饱和后形成的谷甾烷醇几乎不被吸收，而豆甾醇在这3种甾醇主要成分中最难被吸收[25-26]。甾醇B在体外发酵试验中效果较好可能是其β-谷甾醇含量最低，而β-谷甾醇在几种甾醇中占比最高，接近一半，所以影响较大。

总之，添加植物甾醇可以提高微生物发酵的产气量及挥发性脂肪酸产量，同时降低乳酸产量。植物甾醇的添加量比甾醇组分对瘤胃发酵影响更大。综合多个瘤胃发酵指标考虑，添加甾醇B添加量为0.03 μg/mL对瘤胃发酵的促进作用最明显。