枝孢霉菌对喷气燃料性质的影响及降解烷烃机理

2020-09-27牛明明许世海孙新枫

石油学报（石油加工） 2020年4期

牛明明，苏鹏，熊云，许世海，孙新枫

(陆军勤务学院，重庆 401331)

微生物能够利用喷气燃料储运设施中残留的水分，以烃类化合物为碳源，以胺型抗氧剂、抗静电剂等添加剂及燃料中含有的氮、硫等元素为营养物质进行生长繁殖[1-2]。

微生物的生长繁殖会降解燃料组分和添加剂，影响燃料性质。其生长过程中分泌的表面活性物质、降解烃类化合物产生的酸性物质会影响燃料的洁净性和腐蚀性。研究表明[3]，真菌在生长代谢过程中会分泌出如糖类化合物、多糖脂、脂肽等表面活性物质。如Seghal等[4]在海洋中分离出MSF3真菌，通过溶血实验、液滴坍塌试压和驱油实验等方法检测到该菌在生长繁殖过程中产生了表面活性物质，分析表明该表面活性物质为糖脂蛋白。这些表面活性物质可以降低喷气燃料和培养基相界面的表面张力，促使喷气燃料与水相乳化。

喷气燃料银片腐蚀主要原因在于活性硫化物作用[5-7]。研究表明[5]，硫酸盐还原菌能将非活性硫化物转化为活性硫化物，是喷气燃料微生物腐蚀性的主要微生物。朱俊忠等[7]采用燃灯法定期考察了喷气燃料在硫酸盐还原菌生长繁殖过程中活性硫化物含量的变化，发现随着该菌生长时间的延长，喷气燃料中活性硫化物含量不断增加。同时，崔艳雨等[8]、龙泉芝等[9-10]分别研究了真菌对喷气燃料性质的影响，认为真菌对喷气燃料外观、颗粒度、总酸值的影响较为明显。此外，真菌菌丝相互勾连形成的悬浮物和菌丝聚集形成的生物膜会堵塞过滤器，干扰燃料计量系统，影响飞行安全[11-13]。

为了监控喷气燃料中微生物的生长，防治微生物污染，国际航空运输协会(IATA)和美国材料与实验协会(ASTM)等机构指定了喷气燃料中微生物的检测标准方法，制定了微生物污染等级标准[14-15]。杨浩[16]、李鹏[17]通过基因测序对喷气燃料中的真菌菌种进行了鉴定，认为枝孢霉菌(AmorphothecaResinae)是中国喷气燃料中的优势真菌菌种，即特征真菌。

目前，关于真菌对喷气燃料性质影响的研究，多数只考察了实验始末阶段喷气燃料性质发生的变化，而未研究喷气燃料性质在真菌生长各阶段发生的变化，不能有效为真菌污染的预警和预防提供依据；同时，在以喷气燃料为唯一碳源条件下，真菌对喷气燃料烃类化合物的降解产物、降解机理以及造成喷气燃料性质改变的原因等方面尚不明确。因此，笔者以中国喷气燃料中的特征真菌枝孢霉菌为对象，考察了其生长过程对喷气燃料性质的影响，及其对喷气燃料替代物正十二烷的降解机理，为中国喷气燃料的使用、储存和性能优化提供参考。

1 实验部分

1.1 原料与试剂

枝孢霉菌(AmorphothecaResinae)，菌株编号为2543，中国工业微生物菌种保藏管理中心提供；氢氧化钾、异丙醇、邻苯二甲酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、葡萄糖、无水硫酸镁、二水氯化钙、磷酸氢二铵、氯化钠、酚酞、无水乙醇，均为分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司；α-萘酚醌苯基甲烷(对萘酚苯)，购自上海麦克林生化科技有限公司；蛋白胨，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；硝酸钾，分析纯，购自重庆北碚化学试剂厂；六水三氯化铁，分析纯，购自山东西亚化学工业有限公司；正十二烷、正己烷，色谱纯，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。

Bushnell Haas (BH)培养基主要组分为：0.2 g硫酸镁、0.0265 g二水氯化钙、1 g磷酸二氢钾、1 g 磷酸氢二铵、1 g硝酸钾、0.083 g六水三氯化铁、1 L去离子水。培养基的pH值通过0.10 mol/L的KOH溶液和3.0 mol/L的盐酸溶液调节；钠元素浓度通过氯化钠调整。

1.2 仪器

美国Thermo Fisher公司ECO 1.2超净工作台；日本TOMY Digital Biology公司SX-300快速自动高压灭菌器；美国Agilent Technologies公司7890A气相色谱仪(GC)；美国Agilent Technologies公司7890A/5957C气质联用仪(GC/MS)；承德鼎盛实验机检测设备有限公司JYW-200C全自动表界面张力仪；南京陵武新技术应用开发研究中心NJ-1A石油产品腐蚀实验多用仪；上海仪电科学仪器股份有限公司PHBJ-260雷磁便携式pH计；盐城市凯特实验仪器有限公司TG16G高速离心机；玻璃砂芯过滤装置(上海市新亚净化器件厂0.22 μm滤膜)。

1.3 实验过程

1.3.1 枝孢霉菌生长条件的考察

为了解枝孢霉菌生长繁殖过程，控制喷气燃料储用条件，抑制真菌生长及其对燃料性质的影响，依据ASTM提出的燃料储存环境和真菌适宜生长范围，以菌丝干重为指标，以生长温度(A)、初始pH值(B)和钠元素浓度(C)为因素，按照正交实验设计(见表1)考察影响枝孢霉菌生长繁殖的关键因素：在9个锥形瓶中分别加入40 mL BH培养基，调节其初始pH值和钠元素浓度，灭菌(120 ℃、20 min)后在无菌环境中加入1 mL正十二烷、400 μL枝孢霉菌菌液，置于不同温度的恒温振荡器中以170 r/min振荡生长5 d，称取菌丝干重，分析实验结果。

称取菌丝干重方法：将培养液离心(8000 r/min、10 min)，取菌丝，清洗后烘干2 h(80 ℃)[18]，干燥、冷却30 min，称重；再次烘干、冷却、称重，直至两次称重误差小于0.3 mg。

1.3.2 喷气燃料性能试验

在超净工作台中，将700 mL经过滤除菌的 3号喷气燃料、200 mL灭菌的BH培养基(最佳生长条件)和1 mL枝孢霉菌菌液分别加入试剂瓶，构建以喷气燃料为唯一碳源的生长体系。同时，设置空白实验。将试剂瓶置于25 ℃水浴恒温生长，每天于敞开式摇床中以170 r/min振荡生长45 min。

每隔2 d在油-水界面上方1～2 cm处取喷气燃料油样，按照《喷气燃料银片腐蚀快速试验法(原电池法)》(YLB 08—2001)、《喷气燃料总酸值测定法》(GB/T 12574—1990)、《航空燃料水反应试验法》(GB/T 1793—2008)和《表面活性剂表面张力的测定》(GB/T 22237—2008)分别进行银片腐蚀试验、总酸值测定、水反应试验和表面张力测定，判断枝孢霉菌在生长过程中对喷气燃料腐蚀性、洁净性的影响。

1.4 枝孢霉菌生长规律及其正十二烷降解产物的测定

在三角烧瓶中加入100 mL BH培养基，灭菌后加入2 mL正十二烷[19-20]、1 mL枝孢霉菌菌液，封口后置于恒温振荡器中生长(25 ℃，170 r/min)，构建以喷气燃料替代物正十二烷为唯一碳源的生长体系。每隔1 d取1个样品，用气相色谱测定正十二烷降解率[21]；用气-质联用仪检测枝孢霉菌降解正十二烷的中间产物；以菌丝干重为指标研究枝孢霉菌生长规律，绘制其生长曲线。

正十二烷降解率测定的GC条件为：HP-5色谱柱(30 m×250 μm×0.25μm)，载气(N2)流速为30 cm/s，进口温度为280 ℃，FID检测器温度为300 ℃，进口分流比为10∶1，进样量2 μL，初始柱温60 ℃保留1 min，再以15 ℃/min升温至240 ℃，最后以10 ℃/min升温至300 ℃保留1 min。

中间产物测定的GC运行条件为：HP-5色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，初始柱温60 ℃保留1 min，再以15 ℃/min升温至240 ℃，最后以 10 ℃/min 升温至300 ℃保留1 min。中间产物测定的MS运行条件为：接口温度260 ℃，电子能量 70 eV，电离方式为EI，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，扫描范围(m/z)为50～400。

2 结果与讨论

2.1 环境因素对枝孢霉菌生长的影响

以菌丝干重为指标，枝孢霉菌生长条件优化的正交实验设计结果见表1；实验结果的极差(Range)分析和方差(FRation)分析见表2。由表1可知，3号实验菌丝干重最大，故A1B3C3组合是枝孢霉菌适宜的生长条件，即：生长温度为25 ℃、初始pH值为8.0、钠元素质量浓度为200.0 mg/L。

极差分析和方差分析分别表征实验因素对实验结果影响大小和显著程度。因素极差越大，则对实验结果的影响越大；因素F值大于F0.05时，则该因素的改变对实验结果有显著的影响[22]。由表2可知：B因素极差与方差最大；A、C因素极差很小，方差也较小。因此，对于枝孢霉菌生长，环境pH值的影响最大、最显著；温度和钠元素浓度的影响较小，而无显著性。

表1 正交实验结果

为验证筛选生长条件的可靠性，深入掌握枝孢霉菌的生长规律，为喷气燃料中真菌的控制提供依据，分别在最优生长条件组合A1B3C3和次优生长条件组合A1B2C2下培养枝孢霉菌。枝孢霉菌生长繁殖曲线如图1所示。由图1可知，不同条件下，枝孢霉菌的生长趋势基本一致，即菌丝干重经历了先下降，然后迅速上升，再保持相对平稳。枝孢霉菌接入培养基初期，由于培养基缺乏充足的酶和中间代谢产物，需要一个短暂的适应期，即为枝孢霉菌生长的迟缓期(1～2 d)。迟缓期内，枝孢霉菌繁殖速率较为缓慢，菌丝干重略有下降，但代谢活跃，为下阶段生长繁殖储备了充足的酶、能量和中间产物。从第2 d开始，枝孢霉菌进入快速生长繁殖期(指数期)，菌丝干重快速增加，第5 d时达到最大值。之后，枝孢霉菌的生长繁殖进入稳定期。原因在于，随着枝孢霉菌的生长，生长体系中营养物质不断被消耗、有机酸等毒性代谢产物不断积累、培养基pH值下降，导致枝孢霉菌的繁殖速率下降，死亡数目上升，而趋于平衡。

表2 正交数据处理结果

图1 正交实验结果验证实验图

另外，由图1还可以看出，在最优生长条件下，枝孢霉菌生长繁殖更快，菌丝干重更大，证明了正交实验结果的可靠性。

2.2 枝孢霉菌对喷气燃料银片腐蚀试验的影响

在以喷气燃料为唯一碳源的生长体系中，枝孢霉菌生长22 d后喷气燃料银片腐蚀试验前后的银片如图2所示。由图2可知，试验后银片未出现明显变化，保持自身金属光泽，无腐蚀斑点。这说明枝孢霉菌的生长过程中不会将培养基中的非活性硫化物(硫酸镁等)转化为活性硫化物，对喷气燃料银片腐蚀试验结果无影响，不会增加喷气燃料对银的腐蚀性。枝孢霉菌不能将非活性硫化物转化为活性硫化物，是因为其没有降解非活性硫化物的基因，不能分泌促使非活性硫化物降解的酶，不能有效摄取非活性硫化物或调控进行降解非活性硫化物的氧化反应。

图2 银片腐蚀试验前后银片外观

2.3 枝孢霉菌对喷气燃料总酸值的影响

枝孢霉菌生长繁殖过程中，喷气燃料总酸值(At)变化如图3所示。由图3可知：随着枝孢霉菌生长时间的延长，喷气燃料总酸值呈增加趋势；培养22 d后，喷气燃料总酸值超出了《3号喷气燃料》(GB 6537—2018)标准规定的限值0.015 mg KOH/g，底部喷气燃料已不合格；空白试验中喷气燃料总酸值在实验过程中均在0.005 mg KOH/g左右，未发生明显变化，且均在标准规定范围内。

图3 喷气燃料总酸值变化曲线

实验结果表明，枝孢霉菌在喷气燃料中生长繁殖的过程中产生了酸性物质。产生的大分子有机酸进入了喷气燃料，升高了喷气燃料总酸值。喷气燃料总酸值的增加，会增大喷气燃料对燃料储存、运输以及使用过程中所接触部分金属的腐蚀性，影响设备使用寿命。

2.4 枝孢霉菌对喷气燃料表面张力及其水反应实验结果的影响

喷气燃料和培养基表面张力(Fst)变化曲线见图4。由图4可知，枝孢霉菌在生长繁殖过程中，喷气燃料和培养基表面张力总体上均呈下降趋势，分别下降了2.39%和14.19%，且后者表面张力下降幅度比前者更大。这说明枝孢霉菌在生长代谢过程中分泌出了表面活性物质，引起两相表面张力的下降，且该表面活性物质使水相的表面张力变化更大。原因在于，喷气燃料在水中的溶解度很小，很难被枝孢霉菌接触、摄取和利用，因此枝孢霉菌分泌出表面活性物质，使少量油-水两相乳化。这样可以将部分烃分子以微小液滴均匀分布在乳化液内[23]，有效增加了微生物与烃类物质的接触，促进其对烃类分子的吸收利用[24]。

图4 喷气燃料和培养基表面张力变化曲线

此外，喷气燃料水反应试验结果表明，喷气燃料和水两相没有乳化或沉淀，相界面清晰、清洁，油-水分离程度和界面现象均符合标准要求。这表明枝孢霉菌代谢繁殖产生的表面活性物质，虽然降低了喷气燃料的表面张力，但因产生的表面活性物质数量较少，界面处两相(尤其是喷气燃料)表面张力下降幅度有限，引起两相的乳化程度不大，因而未影响喷气燃料水反应试验的结果。

2.5 枝孢霉菌降解正十二烷规律及其生长曲线

生长体系中正十二烷降解率和枝孢霉菌菌丝干重变化曲线见图5。由图5可知，随枝孢霉菌生长时间的延长，生长体系中正十二烷不断被消耗。初期(0～3 d)正十二烷消耗较慢，后期消耗明显加快，原因在于生长初期体系中枝孢霉菌数量较少，后期枝孢霉菌数量显著增加。枝孢霉菌菌丝干重在迟缓期明显下降，指数期迅速增加，然后再次下降。这是因为迟缓期内，因生长所需的酶等中间产物的缺乏导致枝孢霉菌生长缓慢；快速生长的指数期内，酶等中间产物丰富，枝孢霉菌生长繁殖速率显著加快；指数期后，随着枝孢霉菌的快速生长繁殖，生长体系中的碳源等营养物质不断被消耗，毒性物质不断积累，枝孢霉菌的繁殖数量下降，而死亡数目上升，最终枝孢霉菌死亡数目超过繁殖数目，枝孢霉菌进入数量减少的衰亡期，菌丝干重开始下降。正十二烷的降解消耗量与枝孢霉菌生长量基本保持一致，说明枝孢霉菌以正十二烷为碳源生长繁殖。

图5 正十二烷降解率及菌丝干重变化曲线

2.6 枝孢霉菌降解十二烷的机理

采用GC-MS对正十二烷降解体系的各物质进行检测。共检测到4种物质：2-十二碳烯(C12H24)、2-十二碳烯-1-醇(C12H24O)、2-十二碳烯酸(C12H22O2)和4-羟基丁酸(C4H8O3)。其中，前3种物质在油相中，其质谱图分别见图6、图7和图8；C4H8O3则进入了水相。由此可知，枝孢霉菌降解喷气燃料产生的有机酸进入喷气燃料，使喷气燃料总酸值升高，增加喷气燃料的腐蚀性。但有机酸的酸性较低，且其中无活性硫组分，因而对喷气燃料银片腐蚀试验没有影响；虽然有机酸作为表面活性物质能引起喷气燃料与水界面的表面张力下降，但因其数量有限，对喷气燃料水反应试验也未产生明显影响。由图6可知：最大质荷比的峰m/z为168，下一个质荷比的峰m/z为139，二者相差29，对应为乙基，且m/z为偶数，符合氮律，初步判断m/z=168为分子离子峰，分子式可能为C12H24；下一个质荷比的峰m/z为125，与139相差14，对应为亚甲基；在m/z为43之前峰均与前一个峰的质荷比相差14(亚甲基)；m/z=43和m/z=29的峰分别为正丙基和乙基的峰；m/z=41的峰判断为CH3-CH=CH，因而可以确定双键在2号位；m/z=89可能为杂质峰。因此，可以进一步判断该物质为2-十二碳烯(C12H24)。按以上方法，判断图7、图8对应的物质分别为2-十二碳烯-1-醇和2-十二碳烯酸。

图6 2-十二碳烯质谱图

图7 2-十二碳烯-1-醇质谱图

图8 2-十二碳烯酸质谱图

Rojo等[25-27]认为，微生物在有氧环境下降解烷烃的途径有单末端氧化、双末端氧化和次末端氧化3种，且均是在酶参与下的酶促反应。单末端氧化的第一步是烷烃在酶的作用下将氧原子引入烃的末端甲基形成伯醇，然后伯醇在酶的作用下依次被氧化成醛和羧酸，然后羧酸进入β-氧化，先后生成、去除乙酰辅酶-A，生成减少2个碳原子的烃类，重复以上过程，直至最后生成CO2和H2O。双末端氧化是指烷烃在酶的作用下，同时将2个末端甲基氧化为伯醇，然后依次将其氧化为醛和羧酸，并进入β-氧化；次末端氧化时，烷烃在酶的作用下，先被氧化为仲醇，然后依次被氧化为酮和酯，其中酯又水解为醇和脂肪酸。

根据检测到的中间产物，可推断枝孢霉菌对正十二烷的降解是单末端氧化。即，在酶的作用下，枝孢霉菌先将正十二烷氧化为伯醇，再将伯醇氧化为醛，然后氧化为羧酸。枝孢霉菌对正十二烷的氧化降解机理见图9。其中，GC-MS并没有检测到醛存在，可能是因为醛作为氧化中间产物，其氧化成酸的步骤快速，在体系中存在的时间很短，从而未被萃取到或未被MS捕捉到。