产细菌素菌株A32 食品级培养基组成及发酵条件的优化*

贾丽艳 畅盼盼 张 丽 苏芳翠 郝 林 马淑英

（1山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

（2山西省白酒生物工程研究所教育创新中心，山西太谷 030801）

（3蒙牛乳业太原有限公司，山西太原 030000）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 广泛存在于自然界中，不产毒素和热致敏蛋白，被归为食品级微生物范畴。枯草芽孢杆菌A32（简称菌株A32）是从山西老陈醋醋醅中筛选出的一株能产广谱抑菌素的菌株。菌株A32 可以产抑菌物质H2O2 和细菌素，其发酵液经过氧化氢酶处理后的抑菌能力反映了菌株A32 产细菌素的能力。由于菌株A32 来源明确、食用安全，具有开发成益生菌微生态制剂并应用于食品领域的潜能。

通过选择来源广泛、价格低廉的食品级碳源和氮源，开发一种安全且高产细菌素的食品级培养基，对进一步提高菌株A32 及其所产细菌素在食品中的应用，降低其生产成本，具有重要意义。本研究以食品级原料为发酵底物，通过单因素试验筛选出最适的碳源、氮源，确定最佳的料液比、发酵时间、发酵初始pH、摇床转速；利用PB 试验筛选出关键的影响因子；采用响应面法对筛选出的关键因子进行优化，从而获得高产细菌素A32 的最佳发酵条件。

1 材料与方法

1.1 菌株

菌株A32，分离自山西老陈醋醋醅，山西农业大学食品科学与工程生物工程实验室保藏。

指示菌，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），山西农业大学食品科学与工程生物工程学院保藏。

1.2 试剂

过氧化氢酶（5 000 U/mg），北京索宝来科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、氯化钠、胰蛋白胨等为常规试剂。

高粱粉、土豆粉、小米、绿豆粉、豌豆、黑豆等，均购自山西太谷县家家利超市。

1.3 主要仪器及设备

YS04A 小型高速粉碎机，北京燕山正德机械有限公司；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ/H 电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；ZWY-1102C恒温培养振荡器，上海智诚分析仪器制造有限公司；DHP-500S 型电热培养箱，北京市光明医疗仪器厂；牛津杯，上海兢翀电子科技发展有限公司；Thermo Scientific 移液器，赛默飞世尔（上海） 仪器有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 培养基

发酵培养基：酵母浸膏0.5 g、胰蛋白胨1.0 g、NaCl 1.0 g、蒸馏水100 mL，pH 7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、琼脂粉2.0 g,蒸馏水100 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.4.2 菌株A32 的活化和培养

将菌株A32 接种于牛肉膏培养基中活化，30℃、150 r/min 培养24 h。按照4%的接种量接入发酵培养基中，30 ℃，150 r/min 的条件下振荡培养36 h。

1.4.3 菌株A32 发酵液及其所产细菌素的抑菌性试验

将过氧化氢酶溶解于枯草芽孢杆菌上发酵清液中，使过氧化氢酶终浓度达到5 μg/mL，30 ℃，温浴2 h。取200 μL 过氧化氢酶处理前后的发酵液做牛津杯抑菌试验，测定其抑菌圈直径大小。每组做3 个平行。

1.4.4 培养基的优化

1.4.4.1 碳源的筛选

分别称取15 g 高粱粉、小米粉、土豆粉代替发酵培养基中的碳源酵母膏，加水1 000 mL，胰蛋白胨和氯化钠添加量保持不变，以发酵培养基液体培养基组作为对照组，将菌株A32 以4%接种量接入培养基中，30 ℃、130 r/min 培养36 h，5 000 r/m离心15 min～20 min，做菌株A32 发酵液及其所产细菌素的抑菌性试验，确定最佳碳源。每组做3 个平行。

1.4.4.2 氮源的筛选

在发酵培养基的基础上，以筛选出的最佳碳源为基础，分别称取10 g 绿豆粉、豌豆粉和黑豆粉代替胰蛋白胨作为氮源，加水1 000 mL，氯化钠的添加量保持不变，以不加氮源组为空白对照。将菌株A32 以4%的接种量接入培养基中，30 ℃，130 r/min 培养36 h，做菌株A32 发酵液的抑菌试验，确定最佳氮源。每组做3 个平行。

1.4.4.3 料液比的筛选

在发酵培养基的基础上，选用试验筛选出的最佳碳氮源取代酵母膏和胰蛋白胨，保持水添加量不变，逐倍增加碳源和氮源的添加量，使其料液比分别为：1∶40，1∶20，3∶40，1∶10，1∶8，制备成培养基。将菌株A32 以4%接种量接入培养基中，30 ℃，130 r/min 培养36 h，做菌株A32 发酵液的抑菌试验，确定最佳料液比。每组做3 个平行。

1.4.4.4 起始pH 值的筛选

以最佳料液比为基础，设置起始pH 分别为4、5、6、7、8，制备成培养基。将菌株A32 以4%接种量接入培养基中，30 ℃，130 r/min 培养36 h，做菌株A32 发酵液的抑菌试验，确定最佳起始pH值。每组做3 个平行。

1.4.4.5 发酵时间的确定

以筛选出的最佳起始pH 值和最佳料液比为基础，制备成无菌培养基。将菌株A32 以4%接种量接入培养基中，30 ℃，130 r/min 分别培养24 h、48 h、36 h、60 h、72 h，做菌株A32 发酵液的抑菌试验，确定最佳发酵时间。每组做3 个平行。

1.4.4.6 摇床转速的确定

以筛选出的最佳起始pH 值、最佳料液比、最佳发酵时间为基础，在0 r/min、130 r/min、140 r/min、150 r/min、160 r/min、170 r/min 的转速下，30 ℃培养36 h，做菌株A32 发酵液的抑菌试验，确定最佳摇床转速。每组做3 个平行。

1.4.5 PB 试验设计

依据碳氮源及发酵条件的筛选结果，菌株A32的发酵培养基影响因素包括高粱粉添加量、绿豆粉添加量、料液比、培养基起始pH 值、发酵时间及摇床转速，对以上几个因素进行PB 试验设计见表1。

表1 因子筛选试验因素水平表

1.4.6 Box-Behnken 响应面试验设计

根据PB 试验结果，筛选出对S.aureus 抑菌活性显著的影响因素，结合因素的效应大小和试验中的实际情况，以抑菌圈直径大小为响应值设计三因素三水平的响应面试验（表2），得出其最佳的培养及发酵条件。

表2 响应面优化因素水平表

2 结果与分析

2.1 碳源对菌株A32 产细菌素的影响

以食品级碳源代替发酵培养基的碳源培养菌株A32 并检测其发酵液的抑菌性，结果如图1 所示。由图1 可知，以高粱粉为碳源的菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑菌圈直径为（27.0±0.63） mm，过氧化氢酶处理后的菌株A32 发酵液的抑菌圈直径为（22.3±0.29） mm，表明以高粱粉为碳源的菌株A32 产细菌素的能力最强。造成以上现象的原因可能是：①与菌株A32 的来源有关。菌株A32 分离自以高粱为主要原料的新鲜醋醅，菌株在长期驯化过程中对高粱适应性更强、利用率更高。②与高粱粉营养成分比较丰富有关。高粱除含淀粉65.9%～77.4%，蛋白质8.4%～14.5%，粗脂2.4%～10.4%外，还含有丰富的氨基酸、维生素及矿物元素等营养物质，能够满足菌株所需的营养需求。此外，由于高粱粉来源广泛，成本低廉，因此选择高粱粉作为菌株A32 的碳源。

2.2 氮源对菌株A32 产细菌素的影响

图1 碳源对菌株A32 产细菌素能力的影响

氮源是菌体生长必不可少的原料，对菌体的生长和代谢具有重要意义。氮源对菌株A32 产细菌素的影响结果见图2。由图2 可知，添加氮源后发酵液的抑菌效果均明显高于未添加氮源组，且绿豆粉作为氮源，其发酵液的抑菌效果强于其他对照组。以绿豆粉为氮源的菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑菌圈直径为（21.3±0.29） mm；过氧化氢酶处理后的菌株A32 发酵液抑菌圈直径为（16.4±0.85） mm，表明当氮源为绿豆粉时，菌株A32 产细菌素的能力最强。此外，绿豆粉来源广泛、价格低廉，因此选择绿豆粉作为菌株A32 食品级培养基的氮源。

图2 氮源对菌株A32 产细菌素能力的影响

2.3 料液比对菌株A32 产细菌素的影响

料液比对菌株A32 产细菌素的影响结果见图3。由图3 可知，随着料液比的增大，营养物质浓度增加，菌体的营养条件丰富，生长代谢旺盛，产抑菌物质的能力增强。当料液比为3:40 时，发酵液的抑菌效果达到最优。未经过氧化氢酶处理的菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑菌圈直径为（25.6±1.15） mm，过氧化氢酶处理后，菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑菌圈直径为（22.0±0.30） mm，表明当料液比为3:40 时，菌株A32 产细菌素的能力最强。

图3 料液比对菌株A32 产细菌素能力的影响

2.4 起始pH 值对菌株A32 产细菌素的影响

pH 是影响微生物繁殖及代谢的重要外界因子，同时调节发酵过程中各种代谢产物及酶活，不同的pH 值通过影响菌体的代谢过程，改变产物的产量及质量，试验结果见图4。由图4 可知，当起始pH值为6.0 时，菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑菌圈直径达到最大。未经过氧化氢酶处理的发酵液对S.aureus 的抑菌圈为（25.8±0.66） mm，处理后的抑菌圈为（23.2±0.53） mm，结果表明起始pH 值为6.0 时，菌株A32 产细菌素的能力最强。

图4 起始pH 对菌株A32 产细菌素能力的影响

2.5 发酵时间对菌株A32 产细菌素的影响

发酵时间对菌株A32 产细菌素能力的影响结果见图5。由图5 可知，当发酵时间达到60 h 时，发酵液对S.aureus 的抑菌效果均达到最大。过氧化氢酶处理前菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑菌圈直径为（29.2±2.21） mm；过氧化氢酶处理后，菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑菌圈直径为（25.4±0.65） mm，表明发酵时间为60 h 时，菌株A32 产细菌素的能力最强。

图5 发酵时间对菌株A32 产细菌素能力的影响

2.6 摇床转速对菌株A32 产细菌素的影响

菌株A32 属于好氧型微生物，其繁殖代谢需要氧气的参与。在发酵液和水中氧气的溶解度较小，需要通过不断的通风和搅拌，使氧气充分进入发酵液中，促进微生物的代谢及繁殖。溶氧的多少也会影响菌体生长和代谢产物含量及质量。同时，充足的氧气虽然有利于菌体的生长和产物合成，但当氧气含量过高时反而会抑制产物的形成。本试验通过调整摇床转速来控制发酵液溶氧量，试验结果见图6。

图6 摇床转速对菌株A32 产细菌素能力的影响

由图6 可知，当摇床转速达到140 r/min 时，菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑制圈直径达到最大。过氧化氢酶处理前，菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑菌圈直径为（24.0±0.63） mm；过氧化氢酶处理后，菌株A32 发酵液的抑菌圈直径为（18.3±0.33） mm，表明当摇床转速为140 r/min 时，菌株A32 产细菌素能力最强。

综合单因素试验，发现过氧化氢酶处理前后，菌株A32 的发酵液的抑菌圈大小的变化趋势一致，表明菌株A32 发酵液的抑菌能力跟菌株A32 产细菌素能力具有一致性。为此，在后期产细菌素发酵条件的优化过程中，用菌株A32 发酵液抑菌圈的大小来反映菌株A32 所产细菌素能力。

2.7 PB 试验结果

设计12 组PB 试验，对培养基组分：高粱粉添加量（A）、绿豆粉添加量（B），发酵条件：料液比（C）、发酵时间（D）、摇床转速（E） 及培养基起始pH 值（F） 共6 个因素进行研究，根据前期试验确定各因素水平，响应值为未经过氧化氢酶处理的菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑菌性大小，试验设计及结果见表3。

表3 Plackets-Burman 试验设计与结果

利用Minitab17 软件对其结果进行方差分析（表4）。回归方程为菌株A32 发酵液抑菌圈直径X=15.879+1.001A+1.206B -0.204C+1.124D -0.166E+0.359F，对模型进行汇总，判定系数R2=0.922 5，该模型的拟合度较好，且模型P=0.012，表明该筛选模型显著。根据表中显著性分析可知，高粱粉添加量（P=0.011）、绿豆粉添加量（P=0.005）、发酵时间（P=0.007） 三者P 值均小于0.05，在α=0.05 的概率水平上差异显著。因此，选择高粱粉添加量、绿豆粉添加量、发酵时间3 个因素进行响应面试验。

表4 Plackets-Burman 试验方差分析

2.8 响应面试验结果

在PB 试验结果分析的基础上，用Design-Expert 软件进行响应面优化试验设计。设计因素组合表及结果见表5。

表5 试验设计方案及结果

应用Design-Expert 软件对所得的试验结果进行回归分析，获得菌株A32 发酵液的抑菌圈直径对高粱粉添加量、绿豆粉添加量、发酵时间的二次多项式回归方程式分别如下：

菌株A32 发酵液的抑菌圈直径X=25.68+1.15A-0.15B-0.12C+1.05AB-0.70AC+0.65BC-1.82A2-2.07B2-4.06C2；

表6 响应面优化二阶回归模型方差分析

根据表6 方差分析结果确定，建立模型的失拟项均不显著，R2为0.905 7，说明该模型的拟合性比较高、误差小，可以采用此模型（回归方程） 代替试验真实点对响应值进行相关预测和分析。同时，由回归方程回归系数显著性检验可知，二次项系数A2、B2、C2的值均小于0.05，说明多个试验因子对响应值的影响具有显著作用；而高粱粉添加量、绿豆粉添加量、发酵时间两两之间的交互作用不显著。

利用响应面软件进行计算分析可得出菌株A32食品级发酵培养基的最佳配方和发酵条件为：高粱粉添加量4.6 g/100 mL，绿豆粉添加量2.9g/100 mL，发酵时间59.2 h。为验证上述试验结果的可靠性，在此最优条件下对菌株A32 食品级发酵培养基的最佳配方和发酵条件进行验证，做3 次平行试验，得出菌株A32 发酵液对S.aureus 的抑菌圈直径为（25.9±0.252） mm，与预测值都十分相近，说明模型方程与实际情况拟合较好，具有可靠的现实意义。因此确定高粱粉添加量4.7 g/100mL，绿豆粉添加量3.0 g/100mL，NaCl 添加量1 g/100mL，发酵时间为60 h，发酵初始pH6，摇床转速140 r/min，即可保证能够得到较高产量的细菌素。

3 结论

通过对菌株A32 食品级培养基原料的筛选，得到其最佳碳源为高粱粉、氮源为绿豆粉；在单因素试验的基础上通过PB 试验和响应面试验对其发酵条件进行优化，得到菌株A32 产细菌素能力最佳的发酵条件为：高粱粉添加量4.7 g/100mL，绿豆粉添加量3.0 g/100mL，NaCl 添加量1 g/100mL，发酵时间60 h，发酵初始pH6，摇床转速140 r/min。