一氧化碳高分子递送载体研究进展

张名扬， 程 健， 胡进明

（中国科学技术大学高分子科学与工程系，中科院软物质化学重点实验室，合肥 230026）

自从诺贝尔奖获得者将一氧化氮（NO）作为心血管系统中重要的生物信号分子以来[1,2]，人们对内源性气体小分子（如一氧化碳（CO）[3]和硫化氢（H2S）[4]）的潜在治疗作用给予了极大关注。CO 是一种无色无味的气体，通常由含碳化合物（如木材、烟草、煤、焦炭等）的不充分氧化而产生。过去，CO 通常被认为是一种有毒气体，极易与血红蛋白结合形成碳氧血红蛋白（COHb），它与血红蛋白的亲合力比氧气（O2）高200～300 倍[3]。人体如果吸入高浓度的CO，体内COHb 浓度会急剧上升。当COHb 占据总血红蛋白的50%～60%时，就会使血红蛋白丧失携氧能力，从而出现呼吸抑制、昏迷抽搐和神经系统受损等症状，尤其是对大脑皮质具有较强毒性[5]；当COHb 在总血红蛋白中超过70%时，可能导致呼吸衰竭或死亡。虽然高浓度CO 对人体有害已经广为人知；但是有趣的是，大量研究表明低浓度CO（10～500 mg/L）对正常细胞的功能可产生重要调节作用。如CO 是心血管、免疫和神经系统的信号分子[6]，能调控一系列生理反应，包括肠道蠕动、血管平滑肌舒张、血小板聚集、细胞增殖与凋亡等[7,8]。在生物体内，CO 的产生途径主要包括血红素（Heme）的降解以及有机分子的氧化，如微粒脂质体的过氧化和有机化合物的光电氧化等[9]。Heme 是氧转运蛋白（血红蛋白、肌红蛋白）和关键细胞过程（如呼吸、炎症和药物代谢）中酶的重要辅因子[10,11]。CO 是血红素氧化酶（HOs）催化血红素分解代谢的副产物之一（图1（a））。在HOs 催化下，血红素的卟啉环（铁原卟啉IX）在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）和O2共存下被氧化，生成胆绿素（Biliverdin）、Fe2+和CO，胆绿素在胆绿素还原酶催化下进一步生成胆红素（Bilirubin）[12,13]。

图1 （a）内源性CO 的主要来源和血红素氧化降解产生CO 的过程[12, 13]；（b）几种重要的外源性CO 释放分子、大分子CO 递送载体及CO 主要生理应用Fig.1 （a）The main sources of endogenous CO and the production of endogenous CO by heme breakdown[12, 13];（b）Typical CO-releasing molecuels（CORMs） and the fabrication of polymeric CO donors for biomedical applications

为了解决CO 在高浓度下毒性和直接使用气体不便操作等问题，研究人员发展了多种CO 释放分子（COreleasing molecules, CORMs）。传统的CORMs 包括无机盐类、过渡金属羰基配合物类和非金属化合物类等，这些分子可用作外源性CO 供体。然而传统的CORMs 主要为小分子，存在半衰期短、释放行为不可控、生物利用度低等局限性。针对上述问题，借助于高分子纳米材料，通过将CORMs 基元物理负载到高分子组装体或者化学键合CORMs 到高分子链中，研究人员成功制备了多种CO 释放大分子。这些CO 释放大分子能够显著提高CORMs 前体基元的稳定性，延长释放时间；更为重要的是，借助于大分子自组装形成超分子组装体，CO 释放大分子能够通过增强渗透和保留效应（EPR）提高在病理组织部位的富集[14]。

本文根据CORMs 与高分子基体的结合方式将CO 释放高分子主要分为3 类，即物理负载型高分子CO 递送载体、高分子后修饰型CO 递送载体和直接聚合型CO 递送载体（图1（b）），通过选择性的实例讨论了不同CO递送载体的构筑方法，并对不同载体的优势与不足进行了简要分析，同时对这一领域的发展方向进行了展望。

1 CO 的治疗作用

近年来，低浓度的CO 作为一种具有多功能的治疗试剂受到了越来越多的关注，在用于炎性疾病[15]（图2（a））、器官移植[16]（图2（b））、心血管疾病[17]（图2（c））和抑制肿瘤生长[18]（图2（d））等方面均表现出显著疗效[19-22]。

图2 CO 在（a）抗炎[15]、（b）器官移植[16]、（c）血管舒张[17]和（d）抑制肿瘤细胞增殖[18]等方面具有显著疗效Fig.2 Therapeutic applications of CO in （a）anti-inflammation[15], （b）organ transplantation[16], （c）vasodilation[17], and （d）antiproliferation[18]

在肿瘤治疗方面，与化学疗法、放射疗法（RT）、光动力疗法（PDT）、光热疗法（PTT）、超声疗法（US）等疗法类似，气体疗法成为了一种应用于肿瘤诊断和治疗的新兴方法。通过严格控制气体浓度，可以利用CO[23]、H2S[24,25]、H2[26-28]和NO[29-33]等气体杀死肿瘤细胞，从而达到治疗目的。在合适的浓度下，这些气体可以逆转癌细胞的Warburg 效应从而抑制肿瘤生长，且对正常细胞不会产生不利影响[34,35]。更为重要的是，气体分子能扩散到肿瘤间质中并无需借助主动转运机制就能穿过生物膜。气体疗法目前已成为一种“绿色”的癌症治疗方式。尽管研究人员在CO 癌症治疗和抗炎症方面已经开展了一系列研究，获得了惊人进展，但目前并未有系统的机理阐明CO 在各种疾病治疗过程中的具体作用分子靶标和特定信号通路。受此限制，CO在癌症治疗中的潜在应用前景仍存在争议。

CO 进入人体的最简单给药途径是吸入CO/空气混合物，已经有一些临床试验用来评估吸入CO 对几种疾病的安全性和有效性[35-37]。美国食品和药物管理局（FDA）将14%（质量分数）的血清COHb 设置为临床试验的上限，并且一些临床试验证实了低剂量吸入CO（250 mg/L，3 h/d）的安全性[38,39]。但这种给药策略缺乏特异性，由于CO 在水中的溶解性较低，与血红蛋白较强的亲和力限制了全身性给药，CO 在体内的分布取决于在身体各个部分的固定分配系数[40]。要获得明显的治疗效果，CO 的浓度、扩散率、组织分布以及在肿瘤组织中的保留率等均至关重要，同时患者的呼吸功能和血红蛋白水平也将在很大程度上干扰CO 吸入的治疗效果。此外，吸入大量的CO 也存在一定的安全风险，血液中CO 浓度过高会引起全身毒性，这些因素严重制约了直接吸入CO 的临床应用。理想的临床治疗剂需要满足无毒易救护、能释放低剂量CO、具有高度生物相容性，能够实现在预定位置和时间以可控方式释放CO[41]。

2 CORMs

Motterlini 等[42]在2002 年首次报道了过渡金属羰基配合物，并且引入了CO 释放分子的概念。CORMs作为一种前药安全可控地释放CO，已被广泛用于模拟和评价CO 的治疗效果。迄今已发现有多种化合物可用作CORMs，包括有机金属化合物醛、草酸盐和硅羧酸盐等[23]。使用最广泛的CO 释放分子是含过渡金属的[RuCl2（CO）3]2（CORM-2）[42]、[Ru（CO）3Cl（glycinate）]（CORM-3）[43]、Mn（CO）4{S2CNMe（CH2CO2H）}（CORM-401）[44]（图3）和硼碳酸盐衍生物Na2（H3BCO2）[45]（图（1））等，这些CORMs 的引用极大地促进了CO相关的生理、病理和药理作用研究[46-48]。传统的CORMs 在生理条件下能够自发释放CO，为了实现CO 释放行为的可控，近年来研究人员还发展了响应型CORMs。根据触发途径差异，已经发展的响应型CORMs 包括光敏感CO 释放分子（photo-CORMs）[49-53]、化学反应型CO 释放分子（CT-CORMs）[54]、酶敏感型CO 释放分子（ET-CORMs）[55]以及温敏型[56]、氧化敏感型[57]和pH[58]敏感型CO 释放分子等。

图3 几类重要的CORMs 化学结构式[42-45, 51-53]Fig.3 Chemical structures of typical CORMs[42-45, 51-53]

3 CO 高分子递送载体

虽然CORMs 的发展为研究CO 的生理功能提供了良好的契机，但在实际应用中仍需解决许多问题。如大多数基于过渡金属配合物的CORMs 稳定性不足、半衰期短，存在提前释放和血液中被快速清除等问题[59]，而非金属型CORMs 虽然稳定性有极大提升，却存在水溶性差、给药浓度不能满足靶组织中的最小有效浓度（MVC）等问题[47,48]。解决上述问题的一个可行办法是将现有的CORMs 与纳米载体有机结合，发展CO 递送纳米载体。纳米载体的形成能够有效提高CORMs 在生理环境下的稳定性、避免被肾脏快速清除、能够通过EPR 效应实现病理组织的富集等[60,61]。目前，聚合物纳米粒子[62]（图4（a））、无机纳米粒子[56]（图4（b））、蛋白质[63]（图4（c））、金属有机框架[64]（图4（d））和纳米凝胶等已经被成功用于构筑CO 递送纳米载体。本文重点关注高分子CO 递送载体，根据CORMs 与高分子基体的结合方式将CO 释放高分子分为3 类。通过部分代表性实例，下文将对不同的构筑方法进行简要评述，并对相关领域的发展趋势进行了展望。

图4 典型的CO 释放纳米载体:（a）胶束纳米粒子[62]，（b）氧化铁纳米颗粒[56]，（c）蛋白质[63]，（d）金属有机框架[64]Fig.4 Fabrication of nanovectors for CO delivery:（a）Micellar nanoparticles[62], （b）Iron oxide nanoparticles[56], （c）Proteins[63], and（d）Metal-organic framework[64]

3.1 物理负载型高分子CO 递送载体

使用高分子载体可以通过提高CO 释放小分子的功效和靶向效率来增加CORMs 的生物利用度。基于生物相容的聚合物，依赖于CORMs 和聚合物基体之间的非共价相互作用，可以以非共价键形式将CORMs 负载到聚合物载体中，而不对CORMs 的完整性（尤其是金属配合物的几何结构、氧化态和立体化学结构）造成影响，并能减轻CO 释放后金属碎片带来的不利影响。这种给药系统使多作用和多靶点给药成为可能，或使治疗和诊断工具相结合成为可能。当设计聚合物作为CORMs 高效载体时，必须考虑聚合物的几个特性，包括尺寸、电荷、结构和降解动力学[59]。

聚合物胶束（PM）系统作为一种常用的高分子载体，近年来由于其增溶、选择性靶向以及亚细胞定位特性而受到越来越多关注[65-68]。胶束是由组装形成的一种纳米胶体颗粒，通常在水性介质中由两亲性嵌段共聚物获得，胶束的大小和形态可以通过聚合物的分子量、嵌段长度、组成和制备方法来调节，聚合物胶束具有独特的性能，如药物负载量高、配制容易、毒性低等。使用胶束封装CORMs 是一种有效的策略，可在降低细胞毒性的同时将CO 稳定运转到活细胞中。Yin 等[69]将疏水性CORM-2 负载到苯乙烯-马来酸共聚物（SMA/CORM-2）胶束中（图5（a））。该胶束流体动力学直径约160 nm，能够分散在水溶液中并缓慢地持续释放CO，经尾静脉注射后在小鼠血液中的半衰期比CORM-2 小分子的长约35 倍；动物实验结果表明该CO 释放胶束对硫酸葡聚糖钠盐（DSS）诱发的炎症性结肠炎和其他活性氧（ROS）相关的疾病（包括炎性肠病）具有一定治疗效果。除物理负载自发释放型CORMs 外，响应型CORMs 也能够被负载到高分子纳米载体中实现可控释放。Peng 等[70]使用聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的嵌段共聚物（Pluronic F127）负载水敏感的环状α-二酮（DKs），该胶束能够显著提高DKs 的稳定性并在470 nm 可见光辐照下释放CO，定量计算结果表明负载的DKs 释放CO 效率达84%（图5（b））。为了避免紫外光和可见光在生理环境下使用时穿透深度不足的问题，Pierri 等[71]将 铥（Tm）和 镱（Yb）掺 杂 的NaGdF4上 转 换 纳 米 粒 子（upconversion nanoparticles, UCNPs）和[Mn（bpy）（CO）2（PPh3）2]+配合物同时负载到两亲性聚合物胶束中（图5（c）），实现了近红外光（NIR）诱导的CO 释放。这种胶束体系具有水分散性，并且提供了一个适合装载疏水性photo-CORMs 的微区。在胶束内核中，CORMs 与UCNPs 之间距离非常近，有利于能量转移，从而能够实现980 nm 近红外光触发CO 释放。

图5 通过将CORMs 物理包埋到高分子载体中构筑CO 释放高分子:（a）负载CORM-2 的SMA 胶束载体[69]；（b）负载DKs 的Pluronic F127 胶束[70]；（c）将CORMs 和UCNPs 负载到胶束中，通过上转换实现近红外触发释放CO[71]Fig.5 Fabrication of macromolecular CO donors by physical encapsulation of CORMs into polymeric assemblies:（a）CORM-2-loaded SMA micelle[69]; （b）DKs-loaded micelle assembled from Pluronic F127[70], and （c）CORMs- and UCNPs-coloaded micelle for NIR-triggered CO release[71]

3.2 高分子后修饰型CO 递送载体

通过物理负载CORMs 构筑高分子CO 递送载体虽然实施相对简单，能够最大程度地保留CORMs 本身的性质，然而这些物理负载CORMs 的载体通过静脉注射给药后容易由于血液稀释和血流剪切而发生解离，导致CO 提前释放。为了提高高分子CO 递送载体的稳定性，可将CORMs 共价修饰到高分子基体中，将小分子CORMs 转化为大分子聚前药，这一策略极大地避免了胶束解离过程中CORMs 的暴释。

高分子基体与CORMs 共价结合构筑高分子CO 递送载体首先报道于2010 年，Hasegawa 等[36]合成了聚乙二醇-b-聚鸟氨酸丙烯酰胺-b-聚正丁基丙烯酰胺（PEG-b-POrnRu-b-PnBu）三嵌段共聚物，并引入CORM-2 基元对其进行修饰（图6（a））。这种CORM-2 修饰的三嵌段聚合物能够自组装为直径30～40 nm 的胶束，该胶束在水溶液中分散性良好。研究表明，将疏水性CORM-2 共价修饰到聚合物基体中不仅能够显著提高聚合物的水分散性，而且能够延长CO 释放时间，使共聚物具有明显的抗炎作用。Nguyen 等[72]制备了聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯-b-聚乙烯基苄氯（POEGA-b-PVB）嵌段共聚物，通过与含有巯基的CORMs 进行反应制备了含不同取代基团（R）的POEGA-b-P（VB-R-CORM-2）水溶性两嵌段共聚物（图6（b））。有趣的是，CO 释放的半衰期可以通过调整取代基团实现。相对于前体分子，这些高分子CO 释放载体普遍具有延长的释放时间，并在抑制细菌生长和生物膜形成方面具有潜在应用价值。此外，他们还将CORM-2 修饰到聚乙二醇甲基醚丙烯酸酯-b-聚4-乙烯基吡啶（POEGA-b-P4VP）嵌段共聚物上并通过自组装制备了POEGA-b-P（4VP-CORM-2）胶束[73]（图6（c）），该胶束具有良好的水溶性，并且可以在水溶液中缓慢释放CO。

Bruckmann 等[62]通过将三羰基锰（Mn（CO）3）后修饰到聚（2-羟丙基甲基丙烯酰胺）（PHPMA）上制备了Mn（CO）3-PHPMA。肌红蛋白测定表明，该聚合物的CO 释放量与Mn（CO）3小分子的相近。相对于Mn（CO）3小分子，Mn（CO）3-PHPMA 可将CO 被动递送至肿瘤组织或炎症部位并在光照下实现CO 可控释放。Zhou 等[74]利用主客体相互作用得到了对空气稳定的环糊精稳定的环戊二烯二羰基铁功能化的聚苯乙烯衍生物（P（CD/FpMSt）），该聚合物在固体和溶液中相对稳定，在光照条件下能够释放CO，为发展含空气敏感金属配合物的CO 释放高分子提供了思路。必须指出，将CORMs 共价修饰到聚合物基体中虽然能够提高负载效率和稳定性，但是这种策略需要考虑如下问题:首先，CO 供体与高分子基体之间的共价结合会改变CORMs 的化学结构从而影响其CO 释放行为；其次，高分子基体和CORMs 之间的共价键需要在递送过程中保持稳定，在到达病理组织时能够自发释放或者在适当外部刺激下释放CO[59]。

图6 高分子后修饰制备CO 释放高分子:（a）基于PEG-b-POrnRu-b-PnBu 三嵌段聚合物的CO 释放高分子用于抗炎症治疗[36]；（b）POEGA-b-P（VB-R-CORM-2）嵌段共聚物用于抗菌[72]；（c）POEGA-b-P（4VP-CORM-2）嵌段共聚物的自组装[73]Fig.6 Fabrication of CO-releasing macromolecules through a post-modification procedure:（a）Construction of CO-releasing micelle selfassembled from PEG-b-POrnRu-b-PnBu triblock copolymer and intracellular CO release[36]; （b）CO-releasing POEGA-b-P（VB-RCORM-2） block copolymer for bacterial killing[72]; （c）Self-assembly of CO-releasing POEGA-b-P（4VP-CORM-2） diblock copolymer[73]

3.3 直接聚合型CO 递送载体

值得注意的是，在高分子载体中物理负载CORMs 的方法虽然不需要对CORMs 进一步改性，但高分子载体的选择至关重要，而且物理负载的方法通常存在负载效率低和和稳定性不足等局限性[59]。后修饰法能够有效提高负载效率和稳定性，但由于高分子链和反应基团之间的空间位阻效应，通常难以实现官能团完全改性[75]。针对上述问题，近期研究人员通过将CORMs 直接功能化为可以聚合的单体，并通过CORMs 单体的直接聚合成功制备了结构规整的CO 释放高分子[76-78]。如Gandra 等[79]通过开环易位聚合（ROMP）合成了光响应型CO 释放高分子（图7（a～c））。该单体和聚合物在黑暗条件下均为相对稳定的状态，但一定强度的光照（550 nm，≤28 mW）可以有效触发CO 释放，并且在CO 释放过程中产生荧光和颜色变化的双重响应。他们进一步制备了含CO 释放高分子的聚四氟乙烯的可拉伸材料（P-PTFE），可被用作简单、廉价和便携的CO 储存绷带。Shao 等[80]近期设计了一种含二苯基环丙烯酮（DPCP）衍生物的原子转移自由基聚合（ATRP）引发剂，通过ATRP 聚合丙烯酸甲酯单体制备了中间连接点为DPCP 衍生物的聚丙烯酸甲酯（DPCP-PMA）（图7（d））。DPCP-PMA 可以在紫外辐射下触发CO 释放，该释放过程可以通过光致发光进行跟踪。

图7 通过直接聚合制备CO 释放高分子:（a）通过ROMP 合成光响应型CO 释放材料；（b）光响应型CO 释放高分子单体的化学结构；（c）P-PTFE 条带在绿光辐照下的颜色变化（ⅰ, ⅱ, ⅲ分别代表纯PTFE 条带，P-PTFE 辐照前和辐照后的条带）；（d）ATRP 制备含CO 释放基元的DPCP-PMA[79, 80]Fig.7 Fabrication of CO-releasing polymers through direct polymerization: （a） Fabrication of photoresponsive CO-releasing polymers via ROMP; （b） Chemical structure of photoresponsive CO-releasing monomer; （c） Macroscopic images of （i） PTFE strip only, （ii）P-PTFE before irradiation and （iii） after irradiation; （d） Synthesis of CO-releasing DPCP-PMA through ATRP using DPCP-based initiator[79, 80]

4 结论与展望

CO 是生命活动中重要的信号分子，对心血管疾病、炎症、肿瘤、细菌感染和器官移植均产生重要影响，利用CO 实现相关疾病的治疗近年来受到了广泛关注。为了避免高浓度CO 产生的系统毒性，实现CO 的靶向递送和可控释放是该领域面临的重要挑战，本文总结了大分子CO 递送载体的近期研究进展。通过物理包埋或者化学键合的途径，研究人员已经成功制备了多种CO 释放大分子，并初步探索了他们在肿瘤治疗、生物膜分散和抗炎症等方面的潜在应用价值。相对于小分子前体，大分子CO 递送载体表现出更高的稳定性、更长的释放时间、增强的病理组织靶向性和较低的系统毒性。

值得注意的是，虽然CO 释放大分子取得了快速发展，不难看出大多数的CO 释放大分子均是通过物理包埋或者高分子后修饰的策略进行制备的，而通过直接聚合的制备途径极少被报道。可能的原因是传统的CORMs 进一步单体化非常困难或者在进一步改性和聚合条件下稳定性不足。因此，这一领域的进一步发展极大程度上依赖于创新型CORMs 的研发。首先，大多数传统CORMs 均为过渡贵金属配合物，这些配合物易于发生配体交换而发生CO 泄露，且重金属离子的生理毒性也需要进一步探讨。令人欣喜的是，近期研究人员已经成功研发了几例非金属型CORMs。其次，目前大多数触发CO 释放的供体分子仅对光照等外源性刺激信号响应，能够对生物内源性信号响应的供体分子仍然非常有限。最后，CO 释放原位检测的手段严重缺乏，而释放过程的原位跟踪将有利于深入理解其生理功能，发展能够原位报告CO 释放的供体分子将是这一领域的另一方向。毋庸置疑，新型CORMs 的发展将极大地促进高分子CO 递送载体这一新兴领域的快速发展，我们期待在不久的将来高分子CO 递送载体能够实际应用于临床相关疾病的治疗。