山鸡椒果实挥发油成分的提取、分析及抑菌活性研究*

赵春丽，彭玉琳，周永强，薛 娟，王泽欢

（贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025）

山鸡椒Litsea cubeba（Lour.）Pets.为樟科木姜子 属植物，又名木姜子、山苍树、山苍子，在我国南部省份云南、贵州、广西、广东等省分布较多[1,2]。在民间山鸡椒的果实因风味特殊多用于腌制各种食品，常作为食品香料使用[3]。木姜子属植物在其根、茎、叶、花、果实、树皮中普遍含有挥发油，具有抗菌和驱虫的功效[4]。近几年抗生素的使用过度，病原菌耐药性逐渐增强，在天然药物中寻找具有抑菌活性的物质具有重要意义。山鸡椒果实中也含有大量挥发油，故对其化学成分及抑菌活性进行研究。本研究采用水蒸气蒸馏法提取山鸡椒果实挥发油，并采用气相色谱-质谱联用法（gaschromatography massspectrometry，GC-MS）对其化学成分进行分析并以峰面积归一化法对各成分进行定量，考察其抑菌活性，为山鸡椒的进一步开发及天然抑菌药物的发现提供实验依据。

1 实验部分

1.1 材料、仪器与试剂

山鸡椒果实采自云南省文山州富宁县，该植物由贵州中医药大学鉴定教研室王泽欢博士鉴定为樟科山鸡椒（Litsea cubeba（Lour.）Pers.）的果实。菌种为贵州中医药大学生物制药实验室菌种，分别为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌。

Agilent 7890B 型气质联用仪（美国 Agilent 公司）；PEGASUS HT 质谱仪（美国 LECO 公司）；DB-5MS 毛细管柱（美国 Agilent 公司）；SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台（浙江苏净净化）；DHP-9082型数显电热恒温培养箱（常州市华普达教学仪器有限公司）；DSX-280KB30 型手提式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；98-I-B 型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；800Y 型高速多功能粉碎机（厂家永康市铂欧五金制品有限公司）；SQP 型万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）。

乙醚、葡萄糖、无水 Na2SO4、无水 KH2PO4、NaCl均为分析纯由国药集团生产。琼脂粉、蛋白胨、酵母粉由Solarbio 生产。

1.2 实验方法

1.2.1 山鸡椒果实挥发油的提取 取约50g 山鸡椒鲜药材于粉碎机中粉碎，以山鸡椒果实挥发油提取量为指标，设计L9（34）正交优化试验，以加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为考察因素，采取三因素三水平正交实验确定最优提取工艺。

1.2.2 GC-MS 分析条件

1.2.2.1 样品制备 取100μL 样品于1.5mL EP 管中，加入 900μL 乙醚，再加入无水 Na2SO4，涡旋 30s，小心移取上清液于2mL 进样瓶（甲烷硅基化的）中，GC-TOF-MS 检测。

1.2.2.2 色谱条件 色谱柱DM-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；柱流速 1.0mL·min-1；进样量 1μL；分流比5∶1；载气为He；柱温箱采用程序升温，起始温度50℃保持 3min，以 5℃·min-1升温至 130℃保持 3min;以 2℃·min-1升温至 180℃保持 2min；以 1℃·min-1升温至280℃保持5min；进样口温度280℃；传输线温度280℃；离子源温度250℃；电离电压-70eV；质量范围20～500；扫描速度10 每秒光谱；溶剂延迟2.6min。

1.2.3 体外抑菌实验 用10% DMSO 水溶液作稀释剂，制成不同体积比（80、40、20、10、5、0mg·mL-1）的山鸡椒挥发油稀释液。将药敏纸片浸泡在上述浓度的挥发油稀释液中30min, 沥干贴于含菌平板上，每板贴5 片，置于恒温培养箱中培养36h,测量抑菌圈直径，结果取平均值。

1.2.4 挥发油最小抑菌浓度（MIC）的测定 将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌转接于LB 培养基中37℃培养12h，白色念珠菌转接于马丁培养基28℃培养24h 后，无菌条件下将各指示菌麦氏比浊度调至0.5。再次稀释1000 倍，将各供试菌加入无菌96 孔板中，每孔100L 药液，每行第1 孔加100μL药液，混匀后移取100μL 到第二孔，以此类推至第7孔作为阴性对照（仅加肉汤不加菌液），8 孔作为阳性对照（仅加肉汤不加菌液）。1 孔至6 孔药物浓度分别为 160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0mg·mL-1，37℃温箱培养18h 后，观察并记录结果。

2 结果与讨论

2.1 山鸡椒果实挥发油提取正交实验结果

以加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）为影响因素，以挥发油为提取量，设计L9（34）正交优化试验，优选挥发油的提取工艺，正交实验因素水平见表1，正交实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 因素水平表Tab.1 Factor level

表2 山鸡椒挥发油提取正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal test for extraction of essential oil from Litsea cubeba（Lour.）Pets

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

根据正交试验表及方差得到正交试验结果:C＞B＞A，提取次数因素大于另两因素，故认为提取次数对结果影响最大，结合方差分析综合考虑，确定最佳提取条件为:加水量为6 倍水、提取时间为2.5h、提取次数为2 次。

2.2 挥发油化学成分分析结果

山鸡椒果实挥发油经检测后得到总离子流图见图 1，通过 ChromaTOF 软件（V4.3，LECO）和 NIST 数据库质谱确认其主要成分，并采用峰面积归一化法进行相对定量，结果见表4。

图1 山鸡椒果实挥发油挥发性成分总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components in Litsea cubeba（Lour.）Pets fruit

表4 山鸡椒果实化学成分表Tab.4 Chemical components of Litsea cubeba（Lour.）Pets fruit

25 2,3,6,7-四甲基辛烷 8.35 846 226571 0.11 26 十甲基环五硅氧烷 8.70 847 56449 0.03 27 对甲酚 8.74 922 4688681 2.19 28 四（三甲硅烷氧基）硅 9.00 882 56676 0.03 29 对甲基苯乙酮 9.67 842 484638 0.23 30 （Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛 10.25 893 1053591 0.49 31 香芹酮 10.39 890 1692054 0.79 32 柠檬腈 10.47 809 179771 0.08 33 甘油 10.54 839 769731 0.36 34 （E）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛 10.66 883 230678 0.11 35 （Z）-3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸甲酯 10.74 876 1296051 0.61 36 香茅醇 11.15 915 4024242 1.88 37 香叶酸甲酯 11.36 829 4512839 2.11 38 香叶醇 11.48 876 11342012 5.31 39 乙酸铯 12.10 971 141414 0.07 40 乙酸香叶酯 12.14 893 32450 0.02 41 反式石竹烯 12.84 810 161591 0.08 42 （E）-β-金合欢烯 13.08 809 106085 0.05 43 香叶酸 13.15 840 90295978 42.24 44 十三烷 14.86 875 673164 0.31 45 石竹素 14.88 918 3526464 1.65 46 十二酸 15.45 916 15563920 7.28 47 利比妥 16.15 945 5862112 2.74 48 邻苯二甲酸二异丁酯 17.79 883 2930077 1.37 49 棕榈酸 19.54 930 11852525 5.54 50 法尼酸 19.84 804 103676 0.05 51 硬脂氧基三甲基硅烷 21.33 898 5966869 2.79 52 正二十烷 24.10 854 159997 0.07 53 正十六烷 24.99 803 40114 0.02 54 六甲基二硅氧烷 26.74 855 37774 0.02 55 三（2,4-二叔丁基）亚磷酸苯酯 30.46 841 707329 0.33

使用 ChromaTOF 软件（V4.3，LECO）和 NIST 数据库质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐、质谱匹配等分析[5]。通过GC-MS 对山鸡椒挥发油成分的分析鉴定，共鉴定出挥发性成分55 种，相对质量分数较高的为香叶酸（42.24%），三甲基苯氧基硅（8.96%），十二酸（7.28%），棕榈酸（5.54%），香叶醇（5.31%），硬脂氧基三甲基硅烷（2.79%），利比妥（2.74%），对甲酚（2.19%），香叶酸甲酯（2.11%），香茅醇（1.88%），石竹素（1.65%），邻苯二甲酸二异丁酯（1.37%），3-甲基-2-环己烯-1-酮（1.21%）。

2.3 山鸡椒果实挥发油抑菌活性测定

山鸡椒果实挥发油抑菌实验结果见表5。

表5 山鸡椒果实挥发油抑菌实验结果（平均抑菌圈半径：mm）Tab.5 Bacteriostatic test results of volatile oil from Litsea cubeba（Lour.）Pets fruit（average bacteriostatic circle radius： mm）

由表5 可知，山鸡椒果实挥发油对实验中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念球菌3 种菌均有抑制作用，抑菌效果随挥发油含量增加而增加，尤以含量到达80mg·mL-1时，3 种菌抑菌效果显著增加，挥发油对枯草芽孢杆菌不敏感；挥发油浓度从20mg·mL-1增加到40mg·mL-1时，抑菌效果大幅增加，以大肠杆菌抑菌效果最为显著。

为了保证实验完整性，在以山鸡椒挥发油稀释液80mg·mL-1为最高浓度的基础上，添加一组数据以160mg·mL-1为最大浓度，并选取了 80、40mg·mL-1一同作为同组实验。

在原有的基础上当山鸡椒挥发油稀释液含量达到160mg·mL-1时，对实验中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念球菌3 种菌抑制作用增强，抑菌效果随挥发油浓度增加而增加，以白色念球菌与金黄色葡萄球菌效果较为显著；挥发油稀释液对枯草芽孢杆菌依旧不敏感。

2.4 挥发油最小抑菌浓度测定

山鸡椒果实挥发油最小抑菌浓度最终结果见表6。

表6 山鸡椒果实最小抑菌浓度Tab.6 Minimum inhibitory concentration of Litsea cubeba（Lour.）Pets fruit

由表6 可知，山鸡椒果实挥发油对供试菌有不同程度的抑制作用，对大肠杆菌最小抑菌浓度（MIC）为40mg·mL-1, 对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度（MIC）为20mg·mL-1，对枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度（MIC）为160mg·mL-1，对白色念球菌最小抑菌浓度（MIC）为 5mg·mL-1。

3 结论

本实验采用水蒸汽蒸馏法提取山鸡椒果实挥发油，通过三因素三水平正交实验确定了最优提取工艺。采用GS-MS 联用法对挥发油的化学成分进行分析，鉴定出85 种挥发性成分，主要为香叶酸，占挥发油化学成分的42.24%。最终实验得出山鸡椒果实挥发油样品质量良好，并具有良好的抑菌活性，对本实验中所用到的金黄色葡萄球菌、白色念球菌、大肠杆菌均有较好的抑菌作用。因此，山鸡椒果实挥发油具有较大的药用开发价值，其药理作用及机制可以进行更深入的研究，可开发具有不同治疗作用的药品，对于不同致病菌所导致的疾病达到一定的预防及治疗作用。