秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的制备及体外表征

石金燕，陈立江，宋 柯，褚宇琦，王惊雷，刘 洋

（辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036）

秦皮甲素（Esculin）是一种香豆素衍生物，具有抗炎、抗肿瘤、降低血尿酸等作用[1-2]。文献[3]表明秦皮甲素脂溶性差，在穿过胃肠道磷脂双分子层时存在吸收障碍。文献[4]报道口服秦皮甲素对降低血尿酸无效，给药剂量大，在体内滞留时间短。《中国药典》2015 年版第四部凡例中，对秦皮甲素的溶解度进行试验的结果表明：秦皮甲素属于微溶[5]。本文鉴于秦皮甲素的理化性质和口服吸收障碍特点，将秦皮甲素做成纳米混悬凝胶剂用于局部皮肤给药，并进行多因素考察、确定最佳处方，以及进行体外表征。

纳米混悬凝胶剂同时具有纳米混悬剂和凝胶剂各自的优点，不仅可提高药物的溶解度，易于吸收，并且可用于局部皮肤给药，解决口服无效的问题[6-8]。近年来，对秦皮甲素的研究还尚有多种可能性。

1 仪器与材料

Mastersizer 3000 激光粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司），FA25 高剪切分散乳化机（巩义市予华仪器责任有限公司），Agilent 1200 高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司），110L 高压微射流纳米分散仪（美国 MFIC公司），KQ5200DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），差示扫描量热分析仪（Diamond DSC，美国Perkin Elmer公司）。

秦皮甲素原料药（批号 F1827013，质量分数 98%，aladdin），秦皮甲素对照品（批号：110740-200104，质量分数99.9%，aladdin），大豆卵磷脂（批号F20150015，沈阳天峰生物制药有限公司），吐温 80（批号 20190103，国药集团化学试剂有限公司），十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）（批号 20151207，北京化学试剂公司），泊洛沙姆 188（poloxamer 188，F68）（批号 WPAK524B，西格马里奥德里奇（上海）贸易有限公司），聚乙烯吡咯烷酮 K30（polyvinylpyrrolidone K30，PVP-K30）（批号 20121016，北京梦怡美生物科技有限公司），甲醇（批号 20181103026，山东禹王实业有限公司化工公司，色谱纯），乙腈（批号20190409，山东禹王实业有限公司化工公司，色谱纯），磷酸（天津科密欧化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 秦皮甲素纳米混悬剂的制备

称取一定量的秦皮甲素溶于 3 mL 甲醇，为有机相（1），另取处方量稳定剂边搅拌边加入到 50 mL纯水中，为水相（2）。（1）均匀滴入（2）中，旋转蒸发除去甲醇，得到粗混悬液。高速剪切初步降低粒径，再通过 1.36 × 108Pa 压力下微射流高压均质 3 次，即得。

2.2 稳定剂的筛选

2.2.1 单一稳定剂种类的筛选

筛选 SDS、吐温 80、大豆卵磷脂等单一稳定剂，以 1︰1 的药辅质量比，按照“2.1”项下沉淀法和微射流高压均质法制备秦皮甲素纳米混悬剂，结果见图 1。以平均粒径越小、多分散系数（polydispersity index，PDI）值越小、Zeta 电位绝对值在 20～30 mV 的范围为稳定性评价指标。图1实验结果所示，使用单一稳定剂不足以维持秦皮甲素纳米混悬剂的稳定，因此下一步继续筛选复合稳定剂。

Fig. 1 Particle sizes, PDI (A) and Zeta potentials (B) of single stabilizer (n = 3)图 1 单一稳定剂的粒径、PDI（A）和Zeta电位的考察（B）（n = 3）

2.2.2 复合稳定剂种类的筛选

根据单一稳定剂种类的筛选结果，考虑固定大豆卵磷脂，将 F68、PVP-K30、SDS 与其搭配使用。为了确保纳米混悬剂系统的稳定性，电荷保护剂和立体保护剂同时存在为最佳。结果显示：大豆卵磷脂与 F68 联合使用为最佳复合稳定剂，降低粒径显著，稳定性最好，见表1。

Table 1 Particle sizes, PDI and Zeta potentials of composite stabilizers (n = 3)表 1 复合稳定剂的粒径、PDI和Zeta电位的考察（n = 3）

2.2.3 助稳定剂 PVP-K30 和 SDS 对最佳复合稳定剂的影响

分别加入助稳定剂 PVP-K30 和 SDS，考察助稳定剂对复合稳定剂的影响。结果显示：助稳定剂的加入并未对最佳复合稳定剂起到加强稳定作用（见表2），需进行其他因素的考察。

Table 2 Effects of stabilizer on optimal composite stabilizers (n = 3)表 2 助稳定剂对最佳复合稳定剂的影响（n = 3）

2.3 其他影响因素的考察

2.3.1 药物与大豆卵磷脂质量比的考察

在“2.1”项下，药物 -F68 的质量比为 1︰1，取药物-大豆卵磷脂的质量比分别为 1︰1、1︰3和 1︰5，测得过微射流 3 次的数据，见表 3。结果表明：随着大豆卵磷脂用量的增加，秦皮甲素纳米混悬剂的粒径逐渐减小，PDI 先增大后减小，Zeta 电位逐渐降低。

Table 3 Effects of the mass ratio of drug and soybean lecithin on esculin nanosuspension (n = 3)表 3 药物与大豆卵磷脂的质量比对秦皮甲素纳米混悬剂的影响（n = 3）

2.3.2 药物与F68质量比的考察

在“2.1”项下，药物-大豆卵磷脂的质量比为 1︰1，取药物-F68 的质量比分别为 1︰1、1︰3和 1︰5，测得过微射流 3 次的数据，见表4。结果表明：随着 F68 用量的增加，秦皮甲素纳米混悬剂的粒径逐渐增加，PDI 先减小后增大，Zeta 电位逐渐降低。

Table 4 Effects of the mass ratio of drug and F68 on esculin nanosuspension (n = 3)表 4 药物与 F68 的质量比对秦皮甲素纳米纳米混悬剂的影响（n = 3）

2.3.3 药物用量的考察

在“2.1”项下，固定稳定剂的质量比，分别取秦皮甲素 50、100 和 150 mg，测得过微射流 3 次的数据，见表 5。结果表明：随着药物用量增加，秦皮甲素纳米混悬剂的粒径逐渐增加，PDI 先减小后增大，Zeta 电位走偏低趋势。可见药物浓度过高，加入的辅料不能维持药物的稳定性。

Table 5 Influence of drug dosages on esculin nanosuspension (n = 3)表 5 药物的用量对秦皮甲素纳米纳米混悬剂的影响（n = 3）

2.3.4 温度的考察

在“2.1”项下，药物与辅料质量比为 1︰1，分别考察 0、25、40 ℃ 下，测得过微射流 3 次的数据，见表6。结果表明：随着药物用量增加，秦皮甲素纳米混悬剂的粒径呈增大趋势，PDI 和 Zeta电位先增大后减小，可见药物在高温下，引起团聚，变的不稳定。故选择 25 ℃ 最适。

Table 6 Influence of temperature on esculin nanosuspension (n = 3)表 6 温度对秦皮甲素纳米混悬剂的影响（n = 3）

2.3.5 剪切转速的考察

在“2.1”项下，药物与辅料质量比为 1︰1，25 ℃ 下，分别在 15 000、18 000 和 20 000 rpm转速下进行剪切，测得过微射流 3 次的数据，见表7。结果表明：增加剪切转速，秦皮甲素纳米混悬剂的粒径在 200 nm 以下，药物分散较好，在混悬液中以稳定状态存在。

Table 7 Influence of shear speed on esculin nanosuspension (n = 3)表 7 剪切转速对秦皮甲素纳米混悬剂的影响（n = 3）

2.3.6 微射流高压均质次数的考察

保持其他条件不变，分别高压均质 3、6、9 次，结果如表8所示。微射流高压均质次数对秦皮甲素纳米混悬剂的粒径、PDI、Zeta 电位的影响不大。

Table 8 Influence of micro-jet high-pressure homogenization times on esculin nanosuspension (n = 3)表 8 微射流高压均质次数对秦皮甲素纳米混悬剂的影响（n = 3）

2.4 星点设计

通过多因素考察，确定大豆卵磷脂用量（A）、F68 用量（B）和剪切转速（C）是影响秦皮甲素纳米混悬剂处方的主要因素。采用 Design Expert 8.0 软件设计星点设计-效应面法，以秦皮甲素原料药 50 mg、纯水 50 mL 设计实验，粒径、PDI 和 Zeta 电位作为评价指标，筛选最优处方[9]。见表9、表10和图2。

Table 9 Factor and level for central composite design表 9 星点设计因素水平表

Table 10 Experimental actors and results of effect surface表 10 效应面实验因素水平及结果

Fig. 2 Predicted response surface diagram图 2 预测效应面图

拟合回归方程及其复相关系数如下：

多元线性回归方程：

粒径 = 156.95 - 32.81A+ 30.87B- 3.18C（r2= 0.573 6）

PDI = 0.33 + 0.027A- 0.011B- 0.030C（r2= 0.188 0）

Zeta电位 = -11.49 + 0.79A- 0.81B- 3.92C（r2= 0.255 4）

多元非线性回归方程：

粒径 = 172.93 - 40.55A+ 28.13B- 10.92C- 7.55AB+ 37.06AC+ 23.52BC- 9.37A2+ 2.71B2-9.01C2（r2= 0.931 0）

PDI = 0.30 + 0.042A- 0.026B- 0.055C- 7.593E-003AB+ 0.068AC- 0.071BC+ 0.023A2+7.837E-003B2- 0.021C2（r2= 0.949 5）

Zeta电位 = -9.96 + 4.68A- 3.20B- 6.90C- 5.22AB+ 1.17AC+ 5.86BC+ 4.14A2- 1.79B2- 3.15C2（r2= 0.963 3）

经过多次重复实验，非线性回归拟合方程和多元线性回归拟合方程的复相关系数r2值较低，表明模型拟合效果不好，自变量与因变量之间相关性较差。删除几个极端数据后，可以看出多元非线性回归拟合方程相关系数r2值明显提高，说明此回归方程的拟合程度良好，可作为预测和优化的模型。从模型中可以看出，在一定范围内，随着大豆卵磷脂用量的增加，秦皮甲素纳米混悬剂的粒径慢慢减小，逐渐达到平衡，F68 用量的增加使粒径呈增大趋势，剪切转速的增大使粒径先减小后增大；随着大豆卵磷脂用量的增加，PDI 增加，F68 用量的增加和剪切转速的增大使 PDI 先增加后减小；随着大豆卵磷脂用量的增加，Zeta 电位随之呈升高趋势，F68 用量的增加使 Zeta 电位先提高后降低，加大剪切转速使 Zeta 电位更稳定。

Table 11 Verification of star point design-effect surface optimization method (n = 3)表 11 星点设计-效应面优化方法的验证（n = 3）

验证试验：依据多元非线性回归方程，选取处方推荐最佳用量：大豆卵磷脂为 35 mg、F68 为 30 mg、剪切转速为 20 000 rpm，测得平均粒径为（171.50 ± 5.22）nm，PDI 为 0.188 ± 0.024，Zeta 电位为（-19.10 ± 0.28）mV，所得结果稳定性好，符合预期。由表11可以看出，本实验所建立的数学模型，可用来预测秦皮甲素的结果评价指标。

2.5 秦皮甲素纳米混悬剂的最佳处方

精密称取 50.01 mg 的秦皮甲素溶于 3 mL 甲醇，为有机相备用（1），精密称取 30.00 mg F68和 35.01 mg 大豆卵磷脂，溶于 50 mL 纯水，为水相备用（2）。（2）搅拌至溶解后，将（1）均匀滴入（2）中，旋蒸 10 min（50 ℃），得到粗混悬液。用高速剪切机以 20 000 rpm 的转速剪切 1 min，再通过 1.36 × 108Pa 压力下，微射流高压均质 3 次，最终得到秦皮甲素纳米混悬剂。

2.6 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的制备

精密称取 0.25 g 卡波姆 940，加入 5 mL 水溶胀 24 h、依次加入秦皮甲素纳米混悬剂 6 mL、丙二醇 2.0 g，充分搅拌混匀后，边搅拌边滴加新鲜配制的体积分数为 20% 的三乙醇胺，调 pH 值至5.0～6.5，加纯水至 20 g，即得，见图3。

Fig. 3 Preparation road map of esculin nanosuspension gel图 3 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的制备路线图

3 体外表征

3.1 外观

秦皮甲素纳米混悬剂出现淡蓝色乳光现象，秦皮甲素纳米混悬凝胶剂涂布性好、稠度适中、细腻、手感好，见图4。

Fig. 4 Esculin nanosuspension (A) and esculin nanosuspension gel (B)图 4 秦皮甲素纳米混悬剂（A）和秦皮甲素纳米混悬凝胶剂（B）

3.2 秦皮甲素纳米混悬剂的粒径、PDI、Zeta 电位分布图

制备的秦皮甲素纳米混悬剂的粒径在 200 nm 以下，分散性好，稳定性高，见图5。

Fig. 5 Particle size, PDI (A) and Zeta potential of of esculin nanosuspension (B)图 5 粒径、PDI（A）和Zeta电位分布图（B）

3.3 透射电子显微镜（Transmission electron microscope, TEM）的考察

将秦皮甲素纳米混悬剂适当稀释，吸取 10µL 滴到粒度为 74µm 的铜网上，自然风干，再滴加 10µL 体积分数为 1% 的磷钨酸（pH 6.4～7.0），静置风干，采用 TEM 观察其形态。结果如图6所示，秦皮甲素纳米混悬剂呈椭圆形分布，粒径都在 200 nm 以下，与马尔文激光粒度仪测定结果大体一致。

Fig. 6 TEM of esculin nanosuspension图 6 秦皮甲素纳米混悬剂的透射电镜图

3.4 扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）的考察

将秦皮甲素纳米混悬凝胶剂适当稀释，滴于锡箔纸上，放置于烘箱内，烘干，制备秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的 SEM 样品，采用 SEM 观察其形态。结果如图7所示，药物被包裹于凝胶基质中，表面光滑且分布均匀。

Fig. 7 SEM of esculin nanosuspension gel图 7 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的扫描电镜图

3.5 差示扫描量热测定（differential scanning calorimetry, DSC）

分别取 4 mg 秦皮甲素原料药、辅料和秦皮甲素纳米混悬剂冻干粉放入坩埚，在 20～250 ℃ 区间，通过氮气保护，每分钟 10 ℃ 升温，图8为 DSC 图谱。由图8对比可见，测得的秦皮甲素纳米混悬剂衍射图中，除了 F68 的峰位，未见药物熔点峰，表明药物可能呈无定型状态。因此，通过X 射线衍射进一步验证药物晶型是否发生改变。

Fig. 8 DSC curves of esculin, soybean lecithin, F68 and esculin nanosuspension图 8 秦皮甲素原料药、大豆卵磷脂、F68、秦皮甲素纳米混悬剂的DSC图

3.6 X射线衍射分析（X-ray diffraction, XRD）

采用 X 射线衍射分析检测药物的结晶度，将研磨好的秦皮甲素原料药、F68 和秦皮甲素纳米混悬剂冻干粉用 XRD-6000 衍射仪检测，见图 9。结果显示：秦皮甲素原料药在 2θ为 10°～30°之间有晶体衍射峰，而 F68 和秦皮甲素纳米混悬剂的 XRD 图谱显示，秦皮甲素纳米混悬剂特征衍射峰消失，说明药物呈无定型状态。与 DSC 结果一致，解释了药物晶型发生改变的结论。

Fig. 9 XRD patterns of esculin, F68 and esculin nanosuspension图 9 秦皮甲素原料药、F68、秦皮甲素纳米混悬剂的XRD图

3.7 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的粒径、PDI、Zeta电位测定

取 0.5 g 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂，加 10 mL 的蒸溜水，超声破坏凝胶的网状结构，用马尔文激光粒度仪检测，测得秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的粒径为（169.90 ± 3.41）nm、PDI 为 0.180 ± 0.037、Zeta 电位为（-27.80 ± 0.21）mV。结果显示：做成凝胶后药物被包裹，稳定性更高。

3.8 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的稳定性考察

将制备的秦皮甲素纳米混悬凝胶剂，连续放置于 4 ℃ 的条件下 10 天，以秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的粒径和 PDI 为考察指标，进行秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的稳定性研究，见图 10。结果显示：秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的粒径（黑色线）以及 PDI（蓝色线）均没有发生显著性改变，溶液也未见沉淀浑浊现象。说明药物制成纳米混悬剂虽呈无定型，但分散在凝胶基质中，可在此时间内稳定存放。

Fig. 10 The storage stability of esculin nanosuspension gel图 10 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的稳定性考察

3.9 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂含量测定

3.9.1 液相检测波长的确定

以甲醇为空白对照，于 200～800 nm 波长下扫描。秦皮甲素在 334 nm 处有吸收，辅料在此处均无吸收。因此，选取秦皮甲素的检测波长为 334 nm。

3.9.2 高效液相（HPLC）分析方法的建立

色谱柱：Hypersil ODS2 C18柱（4.6 mm × 250 mm，5µm）（柱号 E2313718）；流动相：乙腈-0.09%（体积分数）磷酸水溶液（8︰92，体积比）；流速：1.0 mL•min-1；柱温：30 ℃；检测波长：334 nm；进样量：10µL。

3.9.3 对照品溶液的配制

精密称取秦皮甲素对照品 10.00 mg，置于 50 mL 量瓶中，用甲醇定容、摇匀，即得。

3.9.4 供试液的制备

按照“2.6”项下制备的秦皮甲素纳米混悬凝胶剂，加适量甲醇超声破碎，于 8 000 r•min-1离心，取上清液过 0.45µm 微孔滤膜，作为供试液，使用空白凝胶制备空白对照溶液。

3.9.5 标准曲线的制备

精密量取不同体积的秦皮甲素对照品溶液，用甲醇稀释得质量浓度分别为 20、30、40、50、60和 70 mg•L-1的系列溶液，按“3.9.2”中的色谱条件下，测定药物峰面积。

做出标准曲线Y= 2.073 4×104X– 2.333 1×104（r= 0.999 0），在 20～70 mg•L-1的范围内有很好的线性关系。

3.9.6 精密度实验

在同一日内，配制高、中、低 3 个浓度秦皮甲素对照品溶液，采用 HPLC 进行分析，计算日内精密度，RSD 分别为 1.30%、0.35% 和 0.90%。连续 3 日内，将高、中、低 3 个浓度的秦皮甲素对照品溶液分别于同一时刻进样，计算日间精密度，RSD 分别为 1.25%、0.47%、1.68%。RSD均小于 2%，表示仪器精密度良好。

3.9.7 专属性考察

取秦皮甲素对照品溶液、供试品溶液、空白对照溶液，按“3.9.2”项进行 HPLC 分析，记录色谱图。空白对照溶液在药物出峰位置并未出现色谱峰，故认为无杂质干扰，色谱图见图11。

3.9.8 重复性实验

对同一批秦皮甲素，制备 6 份秦皮甲素纳米混悬凝胶剂供试液，按“3.9.2”中的色谱条件下测定药物峰面积，计算 RSD = 0.78%。RSD < 2%，表明实验重复性良好。

3.9.9 回收率考察

精密称取秦皮甲素适量，加入处方比例的聚合物，配制高、中、低 3 个浓度的供溶液，按“3.9.2”项进行 HPLC 分析，见表 12。秦皮甲素的回收率在 98%～102% 之间，且 RSD 值均小于 2%，符合方法学要求，表明此分析方法可行。

Table 12 Recovery of esculin表 12 秦皮甲素的回收率结果

3.10 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂的体外释放度考察

透析法是目前进行体外释放度测定的常用方法，本实验以 40 mL 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）为释放介质，称取约 0.5 g 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂注入预处理过的透析袋中，置于（37 ± 0.5）℃的恒温振荡器中，分别在 0、5、10、30、50、90、120、140 和 180 min 取 1 mL 释放介质，同时补充1 mL 空白释放介质，于 8 000 r•min-1离心，取上清液过 0.45µm 微孔滤膜，测含量并计算释放百分率。称取与秦皮甲素纳米混悬凝胶剂中相应含量的秦皮甲素原料药、F68 和大豆卵磷脂，进行物理混合，得到的物理混合物同法进行试验，作出释放曲线，见图12。由图12可知：秦皮甲素纳米混悬凝胶剂在 50 min 时，药物体外累积释放度已达到 84.52%，而物理混合物仅 49.61%。可见做成秦皮甲素纳米混悬凝胶剂，能显著提高秦皮甲素的累积释放量。

Fig. 12 In vitro release curve of esculin nanosuspension gel and physical mixture (n = 3)图 12 秦皮甲素纳米混悬凝胶剂、物理混合物的体外释放曲线（n = 3)

4 讨论

当 PDI 在 0.1～0.3 之间时，可认为粒径分布较好，Zeta 电位的绝对值大约在 20～30 mV 之间，可认为具有较好的稳定性。由此可见，制备的秦皮甲素纳米混悬剂和秦皮甲素纳米混悬凝胶剂具有良好的稳定性。除药辅质量比、温度和剪切转速以外，高压均质次数并未对粒径、PDI 和 Zeta电位产生显著的影响。由 2.3.4 可知，晶核的生成是放热过程，较高的温度会降低成核速度，导致粒径增大，还会促进奥氏熟化现象。低温和常温有利于反应，为了操作方便，因此，选择常温进行。由 2.3.1 和 2.3.2 可知，随着大豆卵磷脂和 F68 用量的增加，秦皮甲素纳米混悬剂的粒径分别减小和增大，由此可以看出稳定剂的用量是本实验考察的因素，用量过大不仅会覆盖药物，导致粒径变大，还会产生毒性。所以，要筛选最佳稳定剂的用量。由 2.3.5 可知，合适的剪切转速很重要，剪切转速过大，容易引起药物在溶剂中团聚；剪切转速过小，降低粒径力度不够，分布不均匀。

秦皮甲素纳米混悬凝胶剂体外累积释放率优于物理混合物。一是采用沉淀法和微射流高压均质法将药物粒径降至纳米级别，使得药物表面积增大；二是在秦皮甲素纳米混悬凝胶剂中，秦皮甲素为无定型纳米粒，药物的结晶度越低，其饱和溶解度越大。与纯药物相比，秦皮甲素纳米药物的非晶态性质和颗粒尺寸的减小，使其释药率显著提高。能够解决秦皮甲素的溶解度小、溶出速率慢、给药剂量大等问题。而且，纳米混悬剂均匀分散在凝胶的三维网状结构中，不但能增加生物兼容性、提高药物的亲脂性、减少其聚集而增加稳定性、防止药物突释、还能够增加药物在皮肤表面的保留时间，有利于药物的经皮渗透。

此实验将秦皮甲素制成纳米混悬凝胶剂用于外用经皮给药，可减少胃肠道不良反应，避免首关消除等。其中采用常用的凝胶基质卡波姆 940，能够湿润皮肤，增强药物的透皮吸收。大豆卵磷脂是一种生物相容性高的离子表面活性剂，它是构成生物膜的主要成分，它与新剂型结合，制成的秦皮甲素纳米混悬剂，可以改善原药的溶解度和生物膜渗透性[10-11]。在此研究中，可以看出做成纳米级凝胶剂，不但可以提高药物的溶解度，而且增加了药物累积释放量[12-13]，为秦皮甲素的研究提供了一种新的可能性。本实验利用星点设计-效应面优化法，通过较少的实验次数，可对未考察因素的水平有一定的预测。因此，类似方法可应用于其他微溶性香豆素类化合物[14]。