饲料中喹乙醇残留的免疫快速检测

王敏思，朱文博，柳 双，张志军，宋 洋

（1.天津师范大学 生命科学学院，天津300387；2.天津师范大学 天津市动植物抗性重点实验室，天津300387；3.国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津），天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津300384）

喹乙醇（olaquindox，OLA）又称喹酰胺醇、倍育诺、快育灵，分子式为C12H13N3O4，CAS号为23696-28-8.它是一种生长促进剂，可促进蛋白质合成代谢，提高饲料的能量利用率和禽畜个体瘦肉率[1]，被广泛用作猪、鱼的饲料添加剂以提高饲料转化效率[2].近年来，喹乙醇被称为“水产养殖瘦肉精”[3].大量喹乙醇对动物有毒害作用，在动物体内富集会通过食物链导致人致畸、致癌和致突变.喹乙醇的毒性因动物种类不同而不同，对家禽和鱼类具有显著的毒性[4]和特定的遗传毒性[5].因此，欧盟自1999年以来完全禁止使用喹乙醇[6].中华人民共和国农业部批准的国家兽药标准《中华人民共和国兽医药典》和2001年颁布的《饲料添加剂使用标准》明确规定，喹乙醇在养殖业中的使用只能用于体质量不足35 kg的猪，饲料添加量为50 mg/kg，禁止用于家禽和水产养殖的饲料中[7].2018年1月11日，农业部第2638号公告公布，自2018年5月1日起，在养殖业中禁止使用喹乙醇.基于此，建立简便、灵敏、符合国家最新规定的检测喹乙醇残留的分析方法十分必要.

目前，检测喹乙醇常用的方法有高效液相色谱法（HPLC）[8]（HPLC与质谱联用[9]）、酶联免疫吸附实验（ELISA）[10]、仿生酶联免疫吸附实验（BELISA）[11]和定量金免疫层析法[12].2008年Zhao等[10]设计了2种结构抗原，建立了间接竞争性酶联免疫方法（ic-ELISA）检测动物饲料中的喹乙醇，2种抗体的灵敏度（IC50）分别为16.0μg/L和19.0μg/L，检测限（IC15）分别为0.24μg/L和1.02μg/L.2013年Zhao等[11]建立了直接竞争性仿生酶联免疫吸附测定方法，测定鸡饲料中的喹乙醇，IC50和IC15分别为（700.0±60.0）μg/L和（17.0±1.6）μg/L，灵敏度和检测限相对其他方法较低.2016年Pei等[13]建立了金标免疫层析法（GICA）分析动物饲料样品中的喹乙醇，IC50为3.35μg/L，回收率范围为77.33%～86.91%，（变异系数范围为11.47%～23.62%），尽管GICA方法有较高的灵敏度，但准确性有待提高.

本研究基于实验室制备的高灵敏度和特异性的喹乙醇多克隆抗体，拟建立鸡、鱼、猪的3种典型饲料中喹乙醇残留的快速检测方法.通过优化及简化3种样品的前处理方法，有效缩短前处理步骤和检测时间，实现对鸡、鱼、猪饲料实际样品的高效和快速检测.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

喹乙醇，加拿大TRC公司；酶标二抗（羊抗鼠），中国上海斯信生物技术有限公司；牛血清蛋白（BSA），生工生物工程（上海）股份有限公司；β-环糊精，德国Merck公司；过氧化氢脲、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB），美国Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO），中国J＆K公司；NaH2PO4·2H2O，天津金海华兴科技发展有限公司；Na2HPO4·12H2O，天津市大茂化学试剂厂；柠檬酸，成都格雷西亚化学技术有限公司.

pH值为9.6的碳酸钠缓冲液（包被缓冲液）；PBS（0.01 mol/L磷酸钠缓冲液，pH值为7.4）；PBST（1 L PBS加0.50 g吐温）；PBST（1L PBS加0.10 g K2CO3）；PBSB（100 mL PBS+0.1 g BSA）；4.30 mg/mL喹乙醇多克隆抗体（本实验室合成）；样品提取液（甲酸和15%甲醇水溶液的体积比为1∶99）.

1.2 仪器与设备

全波长酶标仪（Labsystems），英国雷勃公司；96孔酶标滴定板，丹麦Nunc公司；数显型酶标板振荡器，美国IKA公司.

1.3 喹乙醇间接竞争ELISA方法的建立

用包被液稀释包被原，使每个孔的量分别为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000μg；将酶标二抗分别稀释2 500、5 000、10 000、20 000倍；将竞争反应时间分别设置为30、40、50、60 min.反应在96孔酶标滴定板中进行，用酶标仪读取A450nm和A650nm值，根据结果中IC50值的大小和吸光度的变化选择最佳反应条件.

利用上述得到的优化条件，分别将喹乙醇配制成0.030、0.300、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000μg/kg的溶液，进行ic-ELISA实验.实验结果以喹乙醇标准品的质量分数（μg/kg）为横坐标，以抑制率（inhibition rate，%）为纵坐标绘制标准曲线.

式（1）中：A质控为喹乙醇标准品浓度为零时的吸光度；Ax为喹乙醇标准品浓度为x时的吸光度；A空白为空白孔的吸光度.

1.4 抗体特异性的评估

通过抗原以及其他抗原结构类似物与抗体的交叉反应率（CR）来判断抗体的特异性[14].

式（2）中：IC50(喹乙醇)为喹乙醇的抑制率为50%时对应的喹乙醇浓度；IC50(其他标准品)为其他标准品的抑制率为50%时对应的标准品浓度.

1.5 样品的测定

1.5.1 样品的准备与处理

分别选择3种饲料（鸡饲料、猪饲料、鱼饲料）作为样品去评估ic-ELISA方法的各项性能指标.所有样品来自当地市场（天津），样品经HPLC检测确保其不含喹乙醇.样品经打磨至均质，备用.

1.5.2 基质影响的消除

鱼饲料：精确称量1.00 g饲料样品（精确到0.01 g）和0.01 g PSA置于离心管中，加入2 mL样品提取液，涡旋5 min，10 000 r/min、5℃下离心10 min，取上清液1 mL过0.45μm滤膜，PBS稀释2倍待测.

猪、鸡饲料：精确称量1.00 g饲料样品置于离心管中，加入1 mL样品提取液，10 000 r/min、5℃下离心10 min，取1 mL上清液，用PBST（1 L PBS加0.10 g K2CO3）稀释3倍待测.

1.5.3 添加回收实验

利用添加回收实验评估ic-ELISA方法的准确度.具体步骤如下：分别对3种饲料样品进行加标回收实验，每种样品分别添加3个质量分数（30、100、200μg/kg），每个重复3次.样品提取液经间接竞争ELISA法分别检测后，计算其回收率（recovery rate），根据回收率接近100%的程度来检验方法的准确度.

1.5.4 实际样品的检测

对天津市场的不同品牌饲料进行抽样调查，每种样品有6种不同来源，每个样品有3个平行.

1.6 方法比对实验

检测条件及方法参考文献[15]，样品处理方法参考文献[16].称取5.00 g饲料，加入10 mL提取液（体积分数为5%的甲醇溶液），室温振荡45 min，3 000 r/min离心10 min，分离出上清液.取SPE小柱，分别加2 mL甲醇和2 mL水，对小柱进行活化.取2 mL上清液过小柱，分别用0.02 mol/L盐酸2 mL、5%的甲醇溶液淋洗，最后用2 mL甲醇溶液（体积分数为40%）洗脱.洗脱液过0.22μm有机相滤膜，滤液上机测定.

2 结果与分析

2.1 ic-ELISA方法的建立

本研究对包被原包被量、酶标二抗稀释倍数以及竞争反应时间进行优化，最终确定的最优条件为：抗体稀释165 000倍，包被原包被量为0.5μg/well，酶标二抗稀释10 000倍，抗原抗体竞争反应时间为50min.绘制标准曲线如图1所示，其中，IC15=（0.6±0.2）μg/L，IC50=（3.2±0.3）μg/L.由图1可以看出，在0.9～8.0μg/L质量浓度范围内线性良好.

图1 喹乙醇抑制曲线Fig.1 Olaquindox inhibition curve

2.2 抗体特异性

利用测定抗体与喹乙醇及其他结构类似物的交叉反应率来评价抗体的特异性.本研究选择几种喹乙醇结构类似物和功能类似物进行分析，结果如表1所示.

表1 各化合物与抗体的交叉反应率和IC50值Tab.1 IC50 and CR of some compounds with antibody

由表1可以看出，喹乙醇抗体除了能够有效识别喹乙醇外，与其他喹乙醇类似物的交叉反应率均较低.由于喹烯酮和乙酰甲喹与喹乙醇有相似的苯环结构，与抗体有一定的亲和性，因此喹烯酮交叉反应率为3.00%，乙酰甲喹为2.20%.其他结构类似物（卡巴多、盐酸克伦特罗、氯霉素）的交叉反应率均小于0.01%.说明该抗体的特异性非常好，能够有效检测样品中的喹乙醇残留.

2.3 基质影响消除结果

猪、鱼、鸡的3种饲料样品经间接竞争ELISA检测获得的抑制率曲线和吸光值曲线分别如图2（a）和2（b）所示.

图2 喹乙醇间接竞争ELISA标准曲线Fig.2 ic-ELISA calibration curve of olaquindox

抑制率曲线即为样品的基质曲线.由图2可以看出，3种饲料的抑制率曲线和吸光值曲线均与标准曲线基本重合，由此可知，样品的前处理方法基本可以达到消除基质影响的目的.

2.4 添加回收实验结果

将每种饲料样品匀浆添加喹乙醇标准品，使其最终质量分数分别为1.0、4.0、8.0μg/kg，每个水平设置3个平行，分别用ic-ELISA和HPLC进行检测，结果如表2所示.由表2可以看出，ic-ELISA回收率为80.0%～100.0%，变异系数（CV）为2.3%～11.1%；HPLC回收率为70.0%～107.5%，变异系数为1.6%～9.9%.2种方法的检测结果基本一致，因此认为ic-ELISA方法可以用于饲料样品中喹乙醇的检测.猪、鸡、鱼的3种饲料的检出限分别为6.0、6.0、4.0μg/kg.

表2 喹乙醇在3种样品中的添加回收率Tab.2 Recovery of olaquindox in three kinds of samples

2.5 实际样品测定

分别用ic-ELISA和HPLC方法检测市售的18件饲料，结果如表3所示.

表3 实际样品中的喹乙醇的检测Tab.3 Detection of olaquindox in real samples

由表3可以看出，3种饲料中均检测出了喹乙醇，总检出率为50%，但并未超标.猪饲料中检出的喹乙醇含量都相对较高，鸡饲料次之，鱼饲料相对比较低.同时发现检出率较高的是鸡饲料，为66.7%；其次是猪饲料，为50%；鱼饲料最低，为33.3%.3种饲料中喹乙醇的添加均未超标.

3 结论

本实验基于ic-Elisa方法，建立了一种快捷、灵敏、准确的饲料中喹乙醇的检测方法.该方法的IC50为（3.2±0.3）μg/L，IC15为（0.6±0.2）μg/L，线性范围为0.9～8.0μg/L.鸡、鱼、猪饲料样品经提取、离心、稀释过膜后，其基质影响可基本消除，整个检测时间仅需2.5 h.通过添加回收实验和HPLC实验验证，该方法有效.3种样品的实际检出限分别为6.0、4.0、6.0μg/kg，均低于已报道的其他方法.因此认为，本研究建立的ic-Elisa方法可高效、准确地检测饲料中的喹乙醇.与以往方法相比，该方法的样品检出限更低，可实现鸡、鱼、猪3种饲料中喹乙醇的精准定性定量分析.