重组酵母菌N6076的差异表达基因功能及甲羟戊酸代谢分析

2020-09-24王璇欧科冯光文陈福欣王婷买买提热夏提买买提钱卫东毛培宏

食品与发酵工业 2020年17期

王璇，欧科，冯光文，陈福欣，王婷，买买提热夏提·买买提，钱卫东，毛培宏*

1(新疆大学物理科学与技术学院放射生态与离子束生物技术中心，新疆乌鲁木齐，830046)2(西安科技大学化学与化工学院，陕西西安，710054)3(陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安，710032)

甲羟戊酸(mevalonate，MVA) 为甲羟戊酸途径(mevalonate pathway，MVP)的中间产物，是酵母细胞代谢过程中一种重要的有机酸和合成具有高附加值的次生代谢产物的前体化合物[1-2]。甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase，MVK)是MVA代谢中关键催化酶和控制整个代谢途径的限速酶之一，也是萜类和醌类物质生物合成过程中的重要调控位点[3-5]。

在前期研究中利用低能离子注入介导药用植物乌拉尔甘草(Glycyrrhizauralensis)基因组DNA 随机转化酿酒酵母菌，获得了遗传稳定的产萜类和醌类化合物的重组酵母菌N6076[6-7]。本文以重组菌株N6076及其原始菌株Kh08 为研究对象，通过转录组测序和MVA的液相色谱-串联质谱法(liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer,LC-MS/MS)定量测定，以期获得2株酵母菌的差异表达基因的功能，并对MVK的表达与MVA的代谢进行关联分析，为进一步理解酵母菌MVA的代谢及调控提供依据，为后续的外源基因在酵母菌基因组中的整合研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)N6076来源于低能氮离子注入介导外源DNA随机转化S.cerevisiaeKh08获得遗传稳定的重组酵母菌，由本中心保存。

1.2 实验方法

酵母菌株的培养基与培养方法参考文献[8]。

用于转录组测序(RNA-seq)的样本制备及其RNA-seq方法、差异表达基因的表达量及其GO功能和KEGG代谢通路分析方法均参考文献[9-10]的方法。

酵母菌胞内MVA测定样本的制备方法与MVA的LC-MS/MS测定方法参考文献[8]。

2 结果与分析

2.1 差异表达基因

2株酵母菌各发酵时间点及相同发酵时间点的差异表达基因的上调和下调分析结果如图1所示。与 0 h相比，重组菌株 N6076发酵至48和 96 h时的上调基因数量分别为 1186 和 1069个，而下调基因的数量分别为 1681和 1377个；与48 h相比，发酵至96 h时上调与下调基因数量分别为 499和291个，而原始菌株 Kh08分别为523 和588个，说明重组菌株N6076在96 h/48 h时的基因表达的总体活跃程度低于原始菌株Kh08。

t1-处理组；t2-对照组图1 重组酵母菌N6076 与其原始菌株Kh08不同发酵时间点的差异表达基因Fig.1 Differentially expressed genes between different time points of fermentation of recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

2.2 差异表达基因的 GO 功能分析

使用GOSeq方法对2株酵母菌的差异表达基因进行GO功能分析结果表明，与原始菌株Kh08相比，重组菌株N6076差异表达基因的GO 功能中的生物学过程(biological process，BP)新增14个，缺失1个；细胞组分(cellular component，CC)新增2个，缺失1个；分子功能(molecular function，MF)新增2个，缺失1个(图2)。重组菌株N6076新增加的14个BP功能涉及213个差异表达基因(表1)，缺失的1个BP功能为NADH再生(GO:0006735)，涉及9 个差异表达基因；在CC功能方面，重组菌株N6076新增了染色质沉默复合物(GO:0005677)和U6 snpRNP(GO:0005688)功能，分别涉及357和372 个差异表达基因；缺失的CC功能为Cul7环泛素连接酶复合物(GO:0031467)，涉及6个差异表达基因；在MF功能方面，重组菌株N6076新增了肌动蛋白丝结合(GO:0051015)和蛋白酶活性(GO:0004291)功能，分别涉及22和176个差异表达基因，缺失了1个ATP酶活性功能(GO:0016887)，涉及10个差异表达基因。

表1 重组菌株N6076新增的BP功能Table 1 New added BP functions of recombinant yeast strain N6076

图2 重组菌株N6076与其原始菌株 Kh08差异表达基因的GO功能Fig.2 The most enriched GO Terms of differential expressed genes of recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08

对相同发酵时间点2株菌株的差异表达基因功能进行分析，结果表明，发酵至48 h，2株酵母菌均包含8种上调表达基因功能，但在下调表达基因功能中，重组菌株N6076与其原始菌株Kh08分别有36和23种；发酵至96 h，2株酵母菌均包含1种上调表达基因功能(DNA ADP核糖基化)，但重组菌株N6076 未富集到下调表达差异基因，而原始菌株Kh08 的下调表达基因为 NADH再生功能。

上述差异表达基因GO功能分析结果表明，重组菌株N6076在BP、CC和MF功能方面均比原始菌株Kh08丰富，这有利于重组菌株次生代谢产物的合成。

2.3 差异表达基因的KEGG代谢通路分析

KEGG代谢通路分析结果表明，2株酵母菌的KEGG注释信息主要包括代谢、遗传信息过程、细胞过程和有机体系等功能，其中，重组菌株 N6076差异表达基因涉及111条KEGG代谢途径，比原始菌株Kh08新增了13 条代谢途径(表2)，涉及77个差异表达基因。

表2 重组菌株N6076新增KEGG代谢途径Table 2 New added KEGG metabolic pathway of recombinant yeast strain N6076

萜类骨架生物合成(KEGG ID：ko00900)是重组菌株 N6076新增的一条重要的代谢途径，为其萜类和醌类等次生代谢产物的生物合成提供了基本的C骨架[11]。在自然界生物体内，萜类物质是生物次生代谢产物的一大类别，并且对于大多数真核细胞、少数原核细胞和高等植物而言，其MVP是合成萜类物质的主要途径。1958年CONRAD和 FEODOR在动物和酵母中发现MVP,且此途径主要存在于细胞质中,又称为细胞质途径[12]。2分子乙酰辅酶 A 在乙酰乙酰辅酶 A 硫解酶的作用下形成乙酰乙酰辅酶 A，然后在 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 合成酶(HMGS)的作用下形成 HMG-CoA[13-14],进而在 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 还原酶 (HMGR)的催化下形成不可逆的MVA[14-16]，NADPH 为该反应的供氢体；MVA在MVK、磷酸甲羟戊酸激酶(MPK)作用下磷酸化，形成甲羟戊酸5-焦磷酸(MVAP)和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVAPP)；最后，MVAPP在 5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MDC)作用下脱羧形成异戊二烯焦磷酸(IPP)，从而进入次生代谢途径，合成相关的萜类、醌类及甾体类物质，与表2中的萜类骨架生物合成代谢途径相符合。

乙酰辅酶A是MVP的前体物质，对于萜类和醌类等次生代谢物质的生物合成起到总量控制的作用，改变乙酰辅酶A的浓度会直接影响次生代谢物质的产量。近年来有研究证实，通过调控乙酰辅酶A的基因表达可以增加MVP中生成乙酰辅酶A的含量，进而提高次生代谢物质在目标载体中的产量[17]。

原始菌株Kh08中调控乙酰辅酶A基因的表达量在0～48 h逐渐增加，48～96 h 降低。而重组菌株N6076中调控乙酰辅酶A基因的表达量在整个发酵过程中呈上升态势，其表达量在 0 h 最低，之后逐渐增加，这为其新增的萜类骨架生物合成提供了前体物质，有利于次生代谢产物的合成。

由于MVA的生成是一个不可逆过程，因此，HMGR (EC∶1.1.1.34)被认为是 MVP中的第1个限速酶[18]。HMGR这个酶的基因的差异表达分析结果表明，重组菌株N6076的HMGR这个酶的基因在48～96 h的KEGG表达中呈下调趋势，涉及差异表达基因5个；而在原始菌株Kh08的KEGG代谢途径中未富集到相关酶基因。这进一步表明，重组菌株N6076中MVA的代谢能力有所增强。

2.4 MVA代谢分析

MVK是MVP中的限速酶之一[19-20]，通过对2株酵母菌MVK基因的表达分析，获得了MVK基因随发酵时间的差异表达趋势(图3-a)。同时利用LC-MS/MS对2株酵母菌不同发酵时间的胞内MVA进行了定量测定，结果如图3-b所示。

图3 重组菌株N6076与其原始菌株Kh08各发酵时间点MK基因表达矩阵与MVA产量Fig.3 MK gene expression matrix and MVA yield of recombinant yeast strain N6076 and original strain Kh08 at different fermentation time points

MVK将ATP-γ位上的一个磷酸基团转移到MVA第5位的羟基上形成MVAP，并释放ADP[21-22]，其酶活性对次生代谢产物的合成速率具有重要的影响作用，并对次生代谢产物的产量有重要影响[23]。重组菌株 N6076 的MVK基因表达量在整个发酵过程中呈起伏上升趋势，0～48 h降低，48～96 h逐渐增加，MVA产量则逐渐积累，至96 h达到峰值。原始菌株Kh08的MVK基因表达量在48～96 h达到峰值，MVA产量在96 h达到峰值。2株酵母菌的MVK基因表达量与MVA产量的变化趋势一致。

重组菌株N6076新增1条萜类骨架生物合成途径(表2)，势必要消耗更多的MVA，因此，发酵48和96 h时，MVA的积累量均低于原始菌株Kh08(图3-b)，说明MVA的代谢速度略快于原始菌株Kh08。