代谢工程改造毕赤酵母发酵生产谷胱甘肽

蒋秋琪，吕雪芹,2，崔世修，刘延峰，堵国成，刘龙*

1(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡，214122)2(江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，214122)

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的非蛋白质硫醇肽，广泛存在于活性生物体中[1-2]。在大多数革兰氏阴性细菌和真核细胞中，GSH的生物合成主要通过两步ATP依赖的酶催化反应完成：1)L-谷氨酸和L-半胱氨酸在γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(γ-GCS，GSHI)的催化下消耗ATP产生γ-谷氨酰半胱氨酸；2)随后谷胱甘肽合成酶(GS，GSHⅡ)催化γ-谷氨酰半胱氨酸和L-甘氨酸产生GSH。基于谷胱甘肽重要的生理活性，例如抗氧化剂[3]、免疫增强剂[4]、氨基酸转运[5]和排毒[6]等，GSH已被广泛用于食品添加剂[7]、化妆品[8]和制药行业[9]。

迄今为止，许多基因工程技术，例如过表达或失活GSH代谢途径中的关键酶等，已用于高产GSH菌株的构建[10]。FEI等将来自酿酒酵母gshⅠ和gshⅡ基因引入到毕赤酵母(Pichiapastoris)，重组酵母中GSH的产量达到4.15 g/L[11]。GE等将带有双功能GshF基因的载体转化到毕赤酵母中，使其GSH产量提高了近80%[12]。据报道，HARA等过表达了硫酸盐同化过程中的MET14和MET16基因，使酿酒酵母细胞内GSH含量分别增加了1.2倍和1.4倍[13]。此外，其他策略包括GSH的跨膜转运[14]，添加前体[15]和运用高压空气处理[16]等，也可提高GSH的产量。

本研究中，基于本实验室保存的产GSH菌株(先前已构建了表达酿酒酵母gshⅠ和gshⅡ基因的毕赤酵母GS115菌株)，致力于优化其gshⅠ和gshⅡ基因的拷贝数，以进一步提高GSH的产量。同时，通过CRISPR/Cas9技术分别敲除GSH降解基因(dug1/dug2/dug3)，以减轻细胞内的GSH分解代谢压力。经过改造，毕赤酵母中GSH的产量显著增加，为未来GSH的工业化生产奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株和培养基

表1列出了本研究中使用的所有质粒和菌株。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)JM109(美国Novagen)用于重组DNA实验。毕赤酵母GS115(基因组整合酿酒酵母gsh+I和gsh+II基因的菌株)被用作表达GSH合成酶的亲本菌株。

表1 本研究中使用的质粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

在含有100 μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani培养基(10.0 g/L胰蛋白，5.0 g/L酵母提取物和10.0 g/L NaCl)中培养大肠杆菌转化体。毕赤酵母在含有0.25 mg/mL G418或0.2 mg/mL潮霉素的YPD培养基(20.0 g/L葡萄糖，20.0 g/L蛋白胨，10.0 g/L酵母提取物)中生长。

1.2 表达载体的构建

1.2.1 表达gsh+I和gsh+II基因载体的构建

分别用引物对F/R-GSH1和F/R-GSH2在毕赤酵母基因组上扩增出gsh+I和gsh+II基因，并用GAP启动子和AOX终止子进行表达。同时，使用引物对(F/R-PICKA-gsh)通过PCR将载体pPICKA线性化。最后，通过Gibson组装将5个片段(GSHI，GSHII，GAP1，GAP2，AOX2)连接到载体上(图1-a)。

1.2.2 用于CRISPR/Cas9的质粒和供体DNA的构建

首先通过重叠延伸PCR将六个引物组装成single guide RNA(sgRNA)。其次将纯化后的sgRNA通过一步克隆法与CRISPR/Cas9质粒相连，构建出载体pCas9-sgRNA-dug3(图1-c)。其中CRISPR/Cas9质粒可从Addgene获得。

使用引物对F/R-UP-donorDNA-dug3和F/R-DOWN-donorDNA-dug3，从GS115基因组上扩增靶基因dug3的5′-上游和3′-下游区域各1 000 bp片段。上游片段的反向引物和下游片段的正向引物彼此共享30～40 bp序列，以此将2个纯化的同源片段通过PCR融合在一起。基因dug2与dug1的敲除方法同dug3。

a-5个片段连接到载体; b-6个引物重叠延伸构建sgRNA;c-载体pCasq-sgRNA-dug3图1 载体pPICKA-gsh12和pCas9-sgRNA-dug3的构建Fig.1 Construction of plasmids pPICKA-gsh12 and pCas9-sgRNA-dug3

1.3 转化与筛选

1.3.1 pPICKA-GSH12转化和G418抗性菌株筛选

首先使用Thermo Scientific Fast Digest限制性内切酶Pme+I将质粒pPICKA-GSH12线性化，根据手册(Invitrogen)通过电转法将线性化质粒转化至毕赤酵母，涂布于含有0.25 mg/mL G418的YPD平板，于30 ℃下孵育2～3 d。选择平板上长出的较大菌落，点涂在含有 2 mg/mL G418质量浓度的YPD平板上。随后继续选择较大菌落，依次点涂在G418浓度逐次上升的YPD平板上(质量浓度梯度为5、10、20、25 mg/L)。最后，选择18个较大菌落和5个较小菌落进行发酵验证。

1.3.2 CRISPR-Cas9质粒、供体DNA的共转化与筛选

将0.5～1 μg环状质粒(pCas9-sgRNA-dug3)和5 μg线性供体通过电转法转化至毕赤酵母，并在含有0.2 mg/mL潮霉素的YPD平板上生长2～3 d。从板中挑选出23个菌落，使用分别位于上下游同源片段上的引物对F/R-dug3，以原始菌株作为对照，验证其是否包含正确整合的供体DNA盒。

1.4 摇瓶培养和GSH含量分析

在斜面培养基上挑取单菌落加入装有20 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，在30 ℃下培养24 h。然后将体积分数为10%的种子液加入到装有20 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中。此时温度、搅拌速度和培养时间分别为30 ℃、220 r/min和48 h。

从发酵液中提取GSH。1 mL发酵液离心后加入等量的5%稀硫酸，将混合物在沸水中煮1 min，以8 000×g的速度离心5 min，取上清液过滤待用。使用HPLC方法分析GSH的含量，流动相中甲醇和10 mmol/L 1-庚烷磺酸钠、50 mmol/L KH2PO4缓冲液(pH 2.8)的比例为5∶95体积比，检测温度为30 ℃，流速为1 mL/min，检测波长为210 nm。

1.5 gsh+I和gsh+II基因拷贝数的定量分析

使用实时PCR测定gsh+I和gsh+II的相对拷贝数。首先，使用总RNA提取试剂盒(TIANGEN)从GS115和GS115-No.10中提取其总RNA。随后，使用Prime ScriptTMRT-PCR试剂盒(TAKARA)将总RNA反转录为cDNA用于下一步检测。以10-1～10-9为梯度稀释纯化的gsh+I基因，以其为模板建立标准曲线。使用引物F/R-gsh1-rtPCR，在Roche Light Cycle®480荧光定量PCR仪进行检测，每个稀释液重复3次。反应结束时，通过软件分析获得目标基因的标准曲线。

2 实验结果

2.1 基于G418筛选具有高拷贝数的gsh+I和gsh+II基因的毕赤酵母

在外源插入酿酒酵母S288Cgsh+I和gsh+II基因的初始毕赤酵母GS115基础上，将线性化的重组质粒pPICKA-gsh12整合其上，这个过程是随机多拷贝发生的。由于质粒上的卡纳抗性基因与表达盒具有遗传连锁，因此可从G418高抗性推断该克隆所包含多拷贝的基因数。依次在含有不同质量浓度G418(2、5、10、20、25 mg/L)的YPD平板上筛选后，选择18个较大菌落和5个较小菌落进行摇瓶发酵。发酵结束后经测定，菌株GS115-No.10的最高摇瓶产量为1.6 g/L，比原始菌株GS115的产量高60%(图2-a)。

通过测定对照菌株GS115和重组菌株GS115-No.10在种子培养和发酵时期的生长曲线可知，在种子培养阶段，对照菌株比GS115-No.10提早进入稳定期(图2-c)。同样地，在发酵阶段，对照菌株比GS115-No.10早8小时进入稳定期(图2-d)。

将线性化的重组质粒pPICKA-gsh12通过5’AOX1位点，同源重组到毕赤酵母的基因组上。提取对照菌株GS115和GS115-No.10菌株的总RNA，并将其反转录为cDNA。然后通过RT-PCR确定这2个菌株中gsh+I基因的起始模板拷贝数。分析可知，经过筛选实验后，靶菌株与对照起始模板拷贝数的比率增加，GS115-No.10的拷贝数约为对照的5倍(图2-b)。此外，在连续3轮培养后，GS115-No.10中GSH的生成无明显变化，表明筛选出来的高拷贝菌株较稳定。

2.2 敲除GSH降解基因dug1/2/3

我们通过敲除dug1，dug2和dug3基因来研究GS115-No.10菌株中GSH产量的变化。首先将质粒pCas9-sgRNA-dug3和供体DNA-dug3共转化到GS115-No.10菌株中。从含有潮霉素的YPD平板上挑选47个转化体，使用F/R-dug3引物对，通过菌落PCR验证。经凝胶核酸电泳分析后，从转化体扩增出1 031 bp和1 978 bp两种条带(图3-c)。经过测定1 031 bp PCR产物的序列可知，供体DNA-dug3序列已成功替换了原始dug3基因的1 978 bp片段。按照上述步骤分别敲除dug1和dug2基因，通过凝胶电泳分析获得了818 bp(对照1 125 bp)和927 bp(对照2 016 bp)的条带。最后，通过传代培养除去游离质粒pCas9-sgRNA。敲除dug3/dug2/dug1基因的菌株用于发酵验证。如图3-a和3-b所示，敲除dug3的菌株干细胞质量为7.5 g/L，比对照低23.6%，而GSH的产量没有明显变化。结果表明，敲除dug基因使单位酵母体积中的GSH含量增加，但酵母的生长受到了影响。

a-对照和23个重组菌株的GSH产量;b-根据GS115-No.10和对照菌株的Ct值计算得出其对应的拷贝数(log)分别为2.9和2.18;c-在种子培养时期对照和GS115-No.10菌株的生长曲线; d-在发酵时期对照和GS115-No.10菌株的生长曲线;1～18号为大菌落，19-23号为小菌落图2 筛选具有gsh+I和gsh+II基因高拷贝的菌株Fig.2 Screening strains for high copy numbers of gsh+I and gsh+II genes

a-对照和敲除菌株的GSH产量; b-发酵44 h时对照和敲除菌株的OD600值; c-敲除dug1/2/3基因电泳图; d-单位质量细胞所含GSH的量图3 敲除GSH分解代谢基因Fig.3 Knockout of GSH catabolic genes

2.3 发酵培养基的优化

2.3.1 葡萄糖浓度的优化

由于单个基因缺失的菌株生长受到一定影响，我们优化了培养基以增强细胞生长。鉴于葡萄糖是毕赤酵母培养基的一种碳源，首先优化了其中的葡萄糖质量浓度。如图4所示，当初始葡萄糖添加量为60 g/L时，dug基因缺失菌株的GSH产量仍为1.6 g/L，但其细胞密度略有增加。在15～60 g/L范围内，培养基中葡萄糖含量与GSH产量正相关。但是，超出此范围，葡萄糖含量与GSH产量不成比例，图4显示，培养基中的葡萄糖越多，GSH的浓度越低。因此我们推断造成酵母生长负面影响的原因可能是葡萄糖效应。

图4 葡萄糖添加量优化后每组的GSH产量和相应的OD600Fig.4 GSH production and corresponding OD600values of each group in the optimization of glucose addition amount

2.3.2 优化添加3种前体

酵母中GSH的合成需要谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的参与。在本研究中，为了优化发酵培养基中这3种成分的添加量，进行了3因素3水平正交实验以确定最佳的方案。根据正交设计的直观分析，如表2所示，分别取各组最大的Ki值所对应的添加量，确定最优方案是谷氨酸添加量为81 mmol/L，甘氨酸27 mmol/L和半胱氨酸13.5 mmol/L，此时GSH摇瓶产量为1.7 g/L。通过方差分析发现，半胱氨酸的F值介于F0.10和F0.05之间，说明在这3个因素中，半胱氨酸的添加量是影响GSH产量的主要因素，而谷氨酸的影响最小。随着半胱氨酸浓度的增加，GSH的产量反而降低，这可能是由于过量添加半胱氨酸会影响细胞生长。

表2 三因素三水平实验分析表Table 2 Three-factor three-level experimental analysis table

表2 方差法分析3种氨基酸的最佳添加量Table 2 Analysis of the optimal addition of three amino acids by variance method

3 讨论

谷胱甘肽在食品、药品和化妆品领域应用广泛。谷胱甘肽合成途径涉及2个酶(GshI和GshII)或一个双功能酶(GshF)。外源基因的拷贝数是影响其在毕赤酵母中表达效率的重要因素之一。产物合成代谢途径中关键酶的表达量与产物的产量有一定关系。由于GshI是谷胱甘肽合成途径中的关键酶[18]，我们过表达了gsh+I基因以增加毕赤酵母中GSH的产量，但是谷胱甘肽的产量反而下降了。从液相色谱-质谱法的结果中可知，与对照相比，过量表达gsh+I基因时的中间产物γ-GC积累更多(数据未显示)。然后，我们在毕赤酵母GS115中同时过表达了gsh+I和gsh+II基因，并使用高浓度抗生素筛选出了具有高拷贝基因的宿主菌，使GSH的产量提高到1.6 g/L。

在实验过程中发现，发酵一定时间后，细胞内谷胱甘肽的含量有明显的下降趋势。由于谷胱甘肽参与细胞内的硫酸盐同化过程，因此推测当细胞内谷胱甘肽过多时，其降解机制被激活以稳定细胞硫代谢平衡[18]。在酵母中发现的包含3个基因dug1，dug2和dug3的GSH降解途径(dug途径)，被认为是GSH降解的主要途径[19-20]。其中，dug1p功能亚基水解谷胱甘肽的一般肽键[21]，而dug2p和dug3p功能亚基参与γ-谷氨酰半胱氨酸和γ-肽键的水解[22]。BAUDOUIN等研究发现△dug2或△dug3突变酵母中GSH的降解几乎被完全阻止，这表明dug2和dug3基因是该过程必不可少的[20]。

通过DNA序列BLAST发现了酿酒酵母中dug基因在毕赤酵母中的同源基因，其蛋白质序列同一性约为64%，表明毕赤酵母中的这个同源蛋白很可能发挥着相似的作用。因此，我们敲除此同源蛋白的对应基因序列。

在这项研究中，我们通过筛选具有高拷贝gsh+I和gsh+II基因的毕赤酵母，并分别敲除在谷胱甘肽降解途径中的3个基因(dug1/2/3)，最后经过培养基优化，将毕赤酵母中GSH的产量提高到1.7 g/L。该研究为实现更经济的谷胱甘肽工业生产奠定了基础。